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L’étude menée par ADNucleis à la demande de groupe O* a pour objectif d’évaluer une méthode de détection automatisée (incluant l’extraction-quantification des ADN et la PCR quantitative) des microorganismes (levures moisissures) pouvant contaminer les pâtisseries industrielles ou en altérer les qualités organoleptiques.
A ce jour, la méthode industrielle de référence utilisée pour la mise en évidence d’une contamination fungique repose sur la culture sur boite de Pétri contenant une gélose Sabouraud additionnée de chloramphenicol. Elle nécessite une incubation de 3 à 7 jours à 28°C pour pouvoir identifier la présence ou l’absence de colonies.
La méthode automatisée du robot Séquence PRO permet de détecter ces contaminants même en très faible quantité (moins de 10 copies) par détection de leurs ADN à l’aide de la PCR quantitative ou qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction).
L’utilisation de cet automate en industrie agroalimentaire pour l’identification de microorganismes contaminants est en plein développement grâce à son avantage majeur : sa rapidité et sa simplicité. En effet, les résultats de l’amplification de l’ADN cible recherché sont obtenus en moins de quatre heures et permettent un gain important de temps pour une libération des produits finis ; éventuellement en cas de non-conformité, elle autorise une rapide mise en place de mesures correctives nécessaires.
Pour répondre à l’étude demandée par le Groupe O., plusieurs kits d’extraction et d’amplification ont été testés et développés.
De plus, une étude de corrélation entre les valeurs de « Ct » (cycle thermique) obtenus en qPCR et le nombre d’UFC (Unité Formant Colonie) obtenues sur boite de Pétri est effectuée. Cette étude comparative permet de déterminer avec précision, à partir de quel « Ct » les produits finis peuvent faire l’objet d’une libération ou d’un retour, et ceci dans un délai court de quelques heures.
Plusieurs types de kits ont été sélectionnés et développés pour cette étude : 2 kits à spectre large et 2 kits spécifiques.
La première étape de cette étude a été d’identifier spécifiquement les microorganismes qui ont pu être isolés sur les chaines de production. Cette étape a permis de développer un modèle d’étude pertinent en lien avec les problématiques réellement rencontrées en milieu industriel et de sélectionner le kit de détection le plus efficace.
Ces résultats ont montré l’importance d’utiliser des kits à spectre large compte tenu de la variabilité des contaminants.
Adnucleis a mis au point, pour cette étude, différents protocoles de prélèvements et pré-traitements des échantillons afin de réaliser une extraction homogène des acides nucléiques. Nos résultats montrent que la qPCR est capable de détecter des cellules viables contaminantes que les méthodes traditionnelles par Pétri ne détectent pas.
La 2ème partie de notre travail consistait à établir une corrélation entre les résultats obtenus via la méthode traditionnelle en boîte de Pétri et les résultats fournis par le SEQUENCE PRO en qPCR.
Les résultats de l’étude montrent que la qPCR est plus sensible que les méthodes traditionnelles sur boite de Pétri, probablement due à son spectre plus large de détection des cibles recherchées.
La recherche d’une très faible contamination, 1 à 2 colonies par g de prélèvement, peut conduire à utiliser une étape d’enrichissement.de quelques heures : cette méthode permet d’obtenir des résultats plus discriminants pour la détection des contaminants fungiques.
En conclusion, l’utilisation de la méthode qPCR couplée éventuellement à l’enrichissement permet d’obtenir une grande sensibilité pour garantir la qualité de la pâtisserie tout en améliorant sa durée de vie. La sensibilité de la méthode permet de mieux définir voire augmenter la DLC tout en guidant les industriels vers de meilleures pratiques de production.
Yannick Lequette, expert biologie moléculaire chez Adnucleis
* Pour des raisons de confidentialité nous tairons le nom du groupe O.
Votre entreprise souhaite réaliser une étude ? Vous souhaitez mettre en place un nouveau protocole de contrôles sanitaires ? Merci de remplir le formulaire suivant ou contacter directement notre laboratoire au +33(0)4 78 56 79 36
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La qPCR (PCR en temps réel) et la LAMP (amplification isotherme médiée par boucle) sont deux méthodes utilisées pour amplifier et détecter des séquences d’ADN spécifiques.
La qPCR est une méthode qui amplifie l’ADN à l’aide de la PCR (amplification en chaîne par polymérase) et mesure simultanément la quantité d’ADN amplifié à l’aide de colorants fluorescents. Le signal fluorescent augmente à mesure que la PCR amplifie l’ADN, et la quantité d’ADN amplifié peut être quantifiée en comparant le signal fluorescent à une courbe standard. La qPCR est très sensible et spécifique et peut être utilisée pour détecter et quantifier de petites quantités d’ADN.
LAMP est une méthode qui amplifie l’ADN à l’aide d’une amplification isotherme (aucun cycle de température n’est requis) et repose sur la liaison spécifique d’amorces à l’ADN cible. La réaction LAMP est suivie par détection visuelle de la turbidité ou de la fluorescence des produits amplifiés. LAMP est également une méthode hautement spécifique et peut être utilisée pour détecter de petites quantités d’ADN, mais elle est moins sensible que la qPCR et peut ne pas être en mesure de détecter des niveaux aussi faibles d’ADN cible.
En bref, la qPCR est une méthode quantitative qui utilise des colorants fluorescents pour détecter et quantifier l’ADN amplifié, tandis que LAMP est une méthode qualitative qui utilise la détection visuelle de l’ADN amplifié. Les deux sont utiles pour détecter et identifier des séquences d’ADN spécifiques.
La qPCR (polymérase en chaîne en temps réel) a plusieurs avantages par rapport à la LAMP (amplification isotherme en boucle):
Sensibilité: La qPCR est généralement plus sensible que la LAMP, ce qui signifie qu’elle peut détecter des niveaux plus faibles d’ADN cible.
Quantification: La qPCR permet de quantifier la quantité d’ADN amplifié grâce à l’utilisation de sondes fluorescentes. La LAMP est généralement utilisée pour la détection qualitative.
Précision: La qPCR est généralement plus précise que la LAMP dans la mesure de la quantité d’ADN cible.
Fiabilité: La qPCR est plus fiable car elle utilise un système de rétroaction en temps réel pour suivre l’amplification de l’ADN cible, ce qui permet d’éviter les faux positifs.
Temps d’analyse: La qPCR est généralement plus rapide que la LAMP, car elle nécessite moins de temps pour amplifier l’ADN cible.
Flexibilité: La qPCR peut être utilisée pour détecter des cibles multiples simultanément, tandis que la LAMP est généralement utilisée pour détecter une seule cible à la fois.
Il est important de noter que les avantages et les limites de la qPCR et de la LAMP dépendent des applications spécifiques et des besoins en matière de détection.
La PCR temps réel est reconnue pour permettre l’isolation, l’identification et la quantification de l’ADN des bactéries, virus, parasites, allergènes, OGM en un temps très court de l’ordre de 1 à 3h dans tous les domaines: hygiène alimentaire, santé animale et/ou santé humaine, industries cosmétiques…
Longtemps restreinte pour des raisons de prix à la détection de quelques pathogènes en hygiène alimentaire ou aux produits à faible durée de vie, l’objectif du Professeur Michel Franck, PDG de ADNucleis, est d’élargir les indications de cette technique PCR à l’identification et la quantification des indicateurs d’hygiène traditionnels (Flore totale, E.coli, coliformes, Pseudomonas spp., Listeria spp., moisissures, levures…) , et/ou les pathogènes (Salmonelles, Listeria monocytogenes, Cronobacter sakazakii, les STEC comme E.coli O157H7, virus, parasites...). Cet objectif est aujourd’hui atteint grâce à une nouvelle méthode « de rupture » à prix équivalents aux prix des méthodes culturales.
Associée au robot PCR SEQUENCE PRO- beaucoup moins onéreux que les traditionnels automates pipeteurs- robot compact (65cm x 65cm) directement positionnable sur les chaînes de productions, l’analyse PCR temps réel peut être réalisée par un personnel non qualifié en biologie moléculaire, in situ et en temps réel.
Grâce à son entourage d’industriels partenaires comme l’entreprise Pasquier entre autre, ADNucleis poursuit sa dynamique pour faire de la PCR temps réel un standard industriel notamment par la simplification et la robotisation de l’ensemble du procédé analytique.
Adnucleis