Evaluation des contaminations fungiques des pâtisseries industrielles par qPCR 

L’étude menée par ADNucleis à la demande de groupe O* a pour objectif d’évaluer une méthode de détection automatisée (incluant l’extraction-quantification des ADN et la PCR quantitative) des microorganismes (levures moisissures) pouvant contaminer les pâtisseries industrielles ou en altérer les qualités organoleptiques.

A ce jour, la méthode industrielle de référence utilisée pour la mise en évidence d’une contamination fungique repose sur la culture sur boite de Pétri contenant une gélose Sabouraud additionnée de chloramphenicol. Elle nécessite une incubation de 3 à 7 jours à 28°C pour pouvoir identifier la présence ou l’absence de colonies.

La méthode automatisée du robot Séquence PRO permet de détecter ces contaminants même en très faible quantité (moins de 10 copies) par détection de leurs ADN à l’aide de la PCR quantitative ou qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction).

L’utilisation de cet automate en industrie agroalimentaire pour l’identification de microorganismes contaminants est en plein développement grâce à son avantage majeur : sa rapidité et sa simplicité. En effet, les résultats de l’amplification de l’ADN cible recherché sont obtenus en moins de quatre heures et permettent un gain important de temps pour une libération des produits finis ; éventuellement en cas de non-conformité, elle autorise une rapide mise en place de mesures correctives nécessaires.

Pour répondre à l’étude demandée par le Groupe O., plusieurs kits d’extraction et d’amplification ont été testés et développés.

De plus, une étude de corrélation entre les valeurs de « Ct » (cycle thermique) obtenus en qPCR et le nombre d’UFC (Unité Formant Colonie) obtenues sur boite de Pétri est effectuée. Cette étude comparative permet de déterminer avec précision, à partir de quel « Ct » les produits finis peuvent faire l’objet d’une libération ou d’un retour, et ceci dans un délai court de quelques heures.

Plusieurs types de kits ont été sélectionnés et développés pour cette étude : 2 kits à spectre large et 2 kits spécifiques.

La première étape de cette étude a été d’identifier spécifiquement les microorganismes qui ont pu être isolés sur les chaines de production. Cette étape a permis de développer un modèle d’étude pertinent en lien avec les problématiques réellement rencontrées en milieu industriel et de sélectionner le kit de détection le plus efficace.

Ces résultats ont montré l’importance d’utiliser des kits à spectre large compte tenu de la variabilité des contaminants.

Adnucleis a mis au point, pour cette étude, différents protocoles de prélèvements et pré-traitements des échantillons afin de réaliser une extraction homogène des acides nucléiques. Nos résultats montrent que la qPCR est capable de détecter des cellules viables contaminantes que les méthodes traditionnelles par Pétri ne détectent pas.

La 2^ème partie de notre travail consistait à établir une corrélation entre les résultats obtenus via la méthode traditionnelle en boîte de Pétri et les résultats fournis par le SEQUENCE PRO en qPCR.

Les résultats de l’étude montrent que la qPCR est plus sensible que les méthodes traditionnelles sur boite de Pétri, probablement due à son spectre plus large de détection des cibles recherchées.

La recherche d’une très faible contamination, 1 à 2 colonies par g de prélèvement, peut conduire à utiliser une étape d’enrichissement.de quelques heures : cette méthode permet d’obtenir des résultats plus discriminants pour la détection des contaminants fungiques.

En conclusion, l’utilisation de la méthode qPCR couplée éventuellement à l’enrichissement permet d’obtenir une grande sensibilité pour garantir la qualité de la pâtisserie tout en améliorant sa durée de vie. La sensibilité de la méthode permet de mieux définir voire augmenter la DLC tout en guidant les industriels vers de meilleures pratiques de production.

Yannick Lequette, expert biologie moléculaire chez Adnucleis

* Pour des raisons de confidentialité nous tairons le nom du groupe O.