Rev 1.0
Target : PRRS NA/HP
MATERIEL :
- ADNUCLEIS RNA extraction purification kit.
- ADNUCLEIS PRRS detection kit
- qPCR
Purification principle : Silica magnetic beads
Biologist contact Dr Yannick LEQUETTE y.lequette@adnucleis.com
IT and robotic contact e : Thomas DUBREUIL, t.dubreuil@adnucleis.com
Send simultaneously to : support@adnucleis.com
Tel +33(0)4 78 57 16 40
PRRS NA detection kit-Introduction
Instruction Manual
Reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) in real time for the qualitative detection of
North America Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus
KIT HQS_PRRS-NA_i_tqm with IPC
48/96 reactions
The kit include and internal positive control
The kit uses the Taqman® probe technology to measure DNA/RNA amplification
Storage conditions:
Keep all reagents at -20 °C until use and after the first use.
Manufacturer ADNUCLEIS SAS Siret 497 802 165 000 17 TVA intraCEE : FR 3649780216500017 * 3 Route des Pierres Blanches F- 69290 GREZIEU LA VARENNE FRANCE
I. Intended use The ADNUCLEIS North America Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) virus (HQS_PRRS-NA/HP_i_tqm) kit uses real time reverse transcriptase polymerase reaction (rt RT-PCR) amplification and is designed for the qualitative detection of North America Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus from a RNA nucleic acid extract. This kit also contains an internal positive control (IPC) of RT-PCR. The kit allows the early diagnosis of presumption of the North America PRRS virus from semen. I. Intended use The ADNUCLEIS North America Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) virus (HQS_PRRS-NA/HP_i_tqm) kit uses real time reverse transcriptase polymerase reaction (rt RT-PCR) amplification and is designed for the qualitative detection of North America Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus from a RNA nucleic acid extract. This kit also contains an internal positive control (IPC) of RT-PCR. The kit allows the early diagnosis of presumption of the North America PRRS virus from semen. II. Introduction Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is the most costly viral disease in the U.S. and around the world (Holtkamp et al.,2013). PRRS affects both the reproductive and grow-finish sectors of the pork industry through a decrease in reproductive health, an increase in mortality and morbidity, and reductions in the rate and efficiency of growth (Zimmerman et al., 2012). PRRS virus (PRRSV) also functions as a cofactor in other disease syndromes, such as porcine respiratory disease complex (PRDC) and PCV-associated disease (PCVAD) (Gillespie et al., 2009; Hansen et al., 2010, Dekkers et al, 2017). The annual cost in production-related losses of PRRS was estimated at $664 million in US in 2013 (+ 18% compare to 2005) (Holtkamp et al.2013). The PRRSV genome comprises a single, positive-sense, polycistronic RNA strand of approximately 15 kb. PRRS viruses are classified in two types:- The type 1 was identified in Europe (EU) and the type 2 in North America in late 80’s. The two viruses cause similar syndrome, but their sequences revealed significant divergence (Brar 2015).
- The PRRS type 2 is subdivided in the two subtypes: the North American PPRS virus (NA) and the Hyper virulent PRRS virus (HP-PRRS) also called the Chinese PRRS virus. The HP-PRRS virus is genetically identical to the NA-PRRS virus except for a deletion of 30 amino acids in a non-structural protein (Nsp 2). The HP-PRRS virus was first discover in China.
Sample preparation - sang
Rev 1.0 (29/06/2017)
Boar semen samples should be kept between 1 and 4 °C or on ice until use. Raw semens are first diluted 1/10 in a buffer (Elixir buffer -genePro). 100 µl of the diluted semen are used for the nucleic acid extraction.Extraction - purification d'ARN - méthode manuelle
Rev 1.0 (27/06/2017)
Matériels et Réactifs fournis par ADNucleis :
- Un kit ADNUCLEIS d’extraction-purification d’ARN viral (kits d’extraction et kits de purification vendus séparément)
- Kit d’extraction de l’ARN: Tampon d’extraction PVG à reconstituer
- PVG (reconstituer le tampon d’extraction dans cette bouteille)
- PE
- TME
- RNA carrier (Conserver à 4°C)
- Kit d’extraction de l’ARN: Tampon d’extraction PVG à reconstituer
- Billes Magnétiques en suspension (µMB)
- Tampon de précipitation SP
- Tampon de Lavage 1
- Tampon de Lavage 2
- Tampon de Lavage 3
- Tampon d’Elution (ELU)
Matériels et réactifs nécessaires et non fournis
- Consommables et matériel
- Plaque deep-well 96 puits (référence obligatoire pour robot : Ritter: Riplate plus PP 1mL ref. n°43001-0016).
- Film aluminium pour plaque 96 puits
- Film X percé.
- kit de purification
- Portoir aimanté ADNUCLEIS pour plaque deep-well
- Non-spécifiques et utilisés dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire: cônes, micropipettes (1mL, 200µL, 20 µl, 10 µl), Etuve stabilisée, bain-marie à 70°C, Bain-marie ou bloc chauffant, centrifugeuse à plaques, gants non poudrés…
- Eau ultrapure (stérile, distillée et nucléases-free).
- ARN Standard.
Etape 1 : Extraction de l'ARN
L’extraction de l’ARN est réalisée par lyse enzymatique et thermique, permettant ainsi la libération des molécules d’ARN de tous les microorganismes et cellules présents dans l’échantillon. Reconstitution du tampon PVG :- Resuspendre la poudre enzymatique PE avec le volume approprié de tampon TME (=ME) à la première ouverture du flacon PE. Homogénéiser.
Réactifs | Volume de TME |
PE 25 mg | 440 µl |
PE 100 mg | 1760 µl |
- Préparer extemporanément suffisamment de mix PVG + ME (100µL de PVG pour 4µL de ME) pour le nombre d’échantillons à extraire +3 (e.g. pour 20 échantillons préparer un mix d’extraction pour 23 échantillons).
- Le RNA carrier doit être ajouté au mix PVG + ME à cette étape. Ajouter 1 µl de RNA carrier par échantillon (e.g. 23 µl pour 23 échantillons)
Réactifs | 1 réaction | 24 réactions | 48 réactions | 72 réactions | 96 réactions |
PVG | 100 µl | 2700 µl | 5100 µl | 7500 µl | 9900 µl |
ME | 4 µl | 108 µl | 204 µl | 300 µl | 396 µl |
RNA carrier | 1µl | 27 µl | 51 µl | 73 µl | 99 µl |
- Distribuer 100µl du réactif d’extraction PVG + ME + RNA carrier dans chaque puits de la plaque deep-well.
- Homogénéiser lentement l'échantillon puis ajouter 100µl dans le puits DeepWell
- homogénéiser par pipetage (3 fois).
- Placer alors la plaque DeepWell contenant les échantillons et PVG sur le bloc chauffant (type Thermoshaker) ou dans un bain marie
- Chauffer suivant les étapes ci-dessous
Temps | Température |
42°C | 20 min |
Etape 2 : Purification de l'ARN
Précautions préalables :- Vérifier le pH du tampon d’élution (pH 8.5 +/-0.2) avant le préchauffage. Ajuster à l’aide d’acide chlorhydrique HCl dilué si nécessaire.
- Préchauffer le tampon d’élution à 70°C.
- Conserver la suspension de billes magnétiques à température ambiante et éloignée du portoir magnétique ou de toutes autres sources de champ magnétique.
- Une fois la purification effectuée, les puits utilisés peuvent être refermés avec un film adhésif (non fourni).
- Pour l’homogénéisation et pour enlever les surnageants et tampons d’élution, utiliser des cônes longs et fins permettant d'aller au fond du puits.
- Introduire verticalement les cônes dans les puits sans toucher les parois
- Régler la pipette multicanaux sur 200. Pour l’homogénéisation, placer les cônes verticalement dans le liquide et pipeter lentement pour éviter les éclaboussures. Les cônes doivent impérativement rester dans le liquide lors de l’homogénéisation pour éviter toutes éclaboussures. Ne pas faire de mousse.
- Homogénéiser lentement
- Lors du pipetage des surnageants et du tampon d’élution, placer les cônes verticalement et introduire dans les puits sans toucher les parois pour ne pas toucher l’amas de billes sur les côtés des puits. Les cônes peuvent être introduits jusqu’au fond des puits avec précaution en pipetant en même temps. Eliminer tout le surnageant.
- Changer de cônes pour chaque tampon et chaque échantillon.
- S’assurer que les cônes soient bien enfoncés sur la pipette. Vérifier la compatibilité des cônes avec la pipette.
- Vérifier visuellement que tous les cônes sur la pipette multicanaux présentent le même volume lors de l’aspiration. Une différence peut être due à un cône mal enfoncé, un cône non adapté à la pipette ou une pipette défectueuse
- Ajouter 70 µl de solution SP (homogénéiser 4 fois par pipetage).
- Bien homogénéiser la suspension de billes magnétiques avant utilisation.
- Prélever 250 µl de suspension de billes magnétiques et les mettre dans chaque puits. Mélanger la suspension de billes magnétiques de temps en temps si vous remplissez une plaque entière.
- Homogénéiser délicatement la solution de billes magnétiques avec l’échantillon par pipetage avec la pipette multicanaux. Faire 3 ou 4 allers-retours. Utiliser un cône différent pour chaque puits.
- Incuber 2 minutes à température ambiante.
- Placer les tubes sur le portoir magnétique pendant 2 minutes. Les billes magnétiques sont capturées sur le côté de chaque puits pour former un amas noir. (Prolonger 1 minute supplémentaire dans le cas de difficulté d’aimantation des billes magnétiques, ce phénomène peut être visible avec des matrices très grasses).
- Éliminer le surnageant avec une pipette multicanaux et des cônes de 250 µl. Pour cela introduire les cônes verticalement dans les puits sans toucher les parois et aspirer le surnageant sans aspirer les billes magnétiques en gardant la plaque sur l’aimant. Aspirer tout le surnageant au fur et à mesure de l’enfoncement du cône d’aspiration en allant jusqu’au fond des puits. L’élimination du surnageant peut se faire en deux fois.
- Ôter la plaque de l’aimant.
- Ajouter 250µl de tampon de lavage 1, homogénéiser délicatement par aspiration-refoulement avec la pipette multicanaux réglée sur 200 µl (voir schéma ci-dessous). Faire 6 allers-retours, puis incuber 1 minute à température ambiante.
- Placer les tubes sur le portoir magnétique pendant 1 minute. Les billes magnétiques sont capturées sur un côté de chaque puits pour former un amas noir. Prolonger d’une 1 minute supplémentaire dans le cas de difficulté d’aimantation des billes magnétiques, ce phénomène peut être visible avec des matrices très grasses.
- Eliminer le surnageant avec une pipette multicanaux et des cônes de 250 µl. Pour cela introduire les cônes verticalement dans les puits sans toucher les parois et aspirer le surnageant sans aspirer les billes magnétiques en gardant la plaque sur l’aimant. Aspirer tout le surnageant au fur et à mesure de l’enfoncement du cône d’aspiration en allant jusqu’au fond des puits. L’élimination du surnageant peut se faire en deux fois.Ôter la plaque du portoir magnétique.
- Ôter la plaque du portoir magnétique
- Ajouter 250µl de tampon de lavage 2: homogénéiser, incuber 1 minute à température ambiante, placer les tubes sur le portoir magnétique pendant 1 minute.
- Eliminer le surnageant par pipetage en deux fois si nécessaire en gardant la plaque sur l’aimant.
- En gardant la plaque sur le portoir aimanté, ajouter 300µl de tampon de lavage 3. Ne pas homogénéiser. Incuber 1 minute à température ambiante, puis éliminer la totalité du lavage 3. Pipeter une 2ème fois si nécessaire pour éliminer la totalité du surnageant.
- S’assurer visuellement de l’absence de tampon de lavage 3.
- Ôter la plaque du portoir magnétique.
- Ajouter 150 µl de tampon d’élution préchauffé à 70°C, remettre en suspension délicatement les billes magnétiques par aspiration-refoulement avec la pipette multicanaux (voir schéma ci-dessous).
- Incuber 2 min à 70°C la plaque pour l’élution de l’ARN.
- Placer la plaque sur le portoir magnétique pendant 1 minute, pipeter 145 µl de surnageant en évitant de prendre des billes magnétiques et transférer l’éluât dans des microtubes propres.
- Si des billes magnétiques ont été pipetées, centrifuger 5 min à 500 g les tubes contenant l’éluât et transférer le surnageant dans des nouveaux tubes sans prendre les billes magnétiques.
RT PCR amplification- manual method
III. Principle of the detection
The ADNUCLEIS RT-PCR kits are using reverse transcription to synthesize RNA into cDNA followed by the amplification of the cDNA by real time RT- PCR. Kits may also include inhibition control (IPC) made of synthetic RNA. This control ensures that a negative result may not be due to the presence of PCR inhibitors at high quantity.
The test is performed from the RNA extracted from the sample. For taqman duplex kits with IPC, the target is usually detected by the FAM channel and the IPC by the JOE/VIC channel (color Probe may be different, please refer to the kit certificat for further information). All emit at a specific fluorescence following its hydrolysis during the elongation of the amplification product. The measurement of the intensities of the real time fluorescence relates the accumulation of specific amplification products.
This amplification system has been validated on:
Table 2
Alternatives:
-channel FAM: (ABI Systems, smartcycler II; Chromo 4/CFX96, System Agilent MX and aria, realplex), channel 530 (LC480), channel Green (RotorGene)
-channel VIC: Channel VIC (ABI systems, Biorad CFX96, Agilent Mx and aria, realplex), channel Alexa 532 (Smart cyclerII), Channel 560 (LC 480); channel Yellow (RotorGene)
Required material and reagents not provided
Positive control: PRRS NA synthetic RNA
IPC: synthetic RNA to control inhibition properties of the sample.
VIII.3 Real time RT-PCR protocol
The Reverse transcriptase reaction is performed before the PCR. The Taq N polymerase is added after the reverse transcriptase reaction is performed.
Once the reverse transcription is done, the Taq N is added into each well.
Dilute the Taq N as follows by multiplying the number of N sample to test ( including positive, IPC, negative controls). On average, prepare enough reagents for N+3 reactions minimum.
Distribute 10 µl of the diluted Taq N with a micropipette and filtered sterile tips in each tube or well of a microplate for real time PCR.
*temperature of the cooling step can vary according to the qPCR instrument. Please contact ADNUCLEIS for further information.
Note 1: set heating and cooling rate by default, up to 20°C/sec, or 100 %
Note 2: For Applied Biosystems, select “none” in “Passive reference”.
Note 3: n RotorGene, please calibrate the signal by clicking n “GAIN OPTIMIZATION”
IX. Validation of the experiment
For the assay to be valid, the Ct values for the controls must be the following.
Outside of these values, the experiment is not valid.
X. Data analysis and interpretation
For clinical samples, the following results are possible:
XI. Performances analysis
XI.1 Studies of repeatability and reproducibility
Studies of repeatability and reproducibility of the kit ADNUCLEIS PRRS NA virus have been achieved using a synthetic RNA by in vitro transcription on a plasmid containing a fragment of the PRRS NA virus.
The tables below indicate the coefficient of variation (CV) depending on the concentration of the RNA
Table of Repeatability (intra-experiment) and reproducibility (inter-experimental)
XI.2 Performance analysis
*average Ct are calculated with the three replicates
*average efficacy, R² and slope are calculated with the three replicates
XII. Biobliography
- A synthetic RNA produced in vitro from a plasmid containing a specific insert of the target or of the IPC.
Components of the kits | 48 reactions | 96 reactions | Reconstitution |
Volume (µl) | Volume (µl) | ||
PCR pre-mix | 1160 | 2000 | Ready to use |
Taq polymerase Nucleis (Taq N) | 116 | 200 | Ready to use |
Reverse transciptase Nucleis (RT N) | 58 | 100 | Ready to use |
PRRS NA RNA Positive control | 200 | 200 | Ready to use |
RNA IPC (inhibitory control) | 150 | 300 | Ready to use |
Target | Fluorophore | Excitation | Emission |
PRRS NA virus | FAM | 499 | 519 |
IPC | VIC | 520 | 548 |
- Elution buffer
- A RNA extraction and purification kit
- Biological hood
- qPCR instrument
- Micro centrifuge
- Vortex
- Plates / tubes for qPCR
- Micropipettes
- Filtre tips for micropipettes
- Sterile microtubes
- A viral RNA extraction and purification kit
- Non powdered gloves
- Read carefully instructions before starting.
- The experiment must be performed by competent staff
- Instruments must have been properly installed, calibrated and maintained according to the manufacturer’s recommendations
- Clinical samples are potentially infectious and must be processed under a laminar flow hood/
- The experiment must be performed according to good laboratory practices
- Do not use this kit after expiration date
- Many freezing/thawing cycles of the reagents must be avoided, and could lead to decrease of sensitivity
- Once defrosted, spin down briefly the tubes before use
- Spin down briefly enzymes tubes to pellet the viscous content at the bottom of the tubes.
- Use of ice or cooling block is mandatory to prepare the mix and dispense reconstituted mix in wells.
- Define 3 working areas: 1)Isolation of DNA/RNA, 2) Preparation of the reaction mix and 3) Amplification/detection of amplified products.
- Pipettes, reagents and other materials must not cross each area
- Specific caution is required to preserve the purity of the reagents and reaction mixtures. The use of gloves is mandatory. Appropriate methods of preparation of DNA should be used.
- Always use filtered tips for micropipettes
- Use specific lab coat and gloves in each working area
- Do not pipette with mouth and do not eat, drink or smoke in the area
- Avoid sprays
- Collect samples in sterile tubes
- The samples should be extracted immediately or frozen from -20°C to 80°C
- Transport of clinical samples must obey local regulations for this type of infectious agents.
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | Positive control + IPC | |||||||||||
B | IPC | |||||||||||
C | Negative control | |||||||||||
D | Sample 1 + IPC | |||||||||||
E | Sample 2 + IPC | |||||||||||
F | … | |||||||||||
G | ||||||||||||
H |
- Homogenize gently the premix tube before starting and spin down brief the premix tubes, enzymes tubes and control tubes.
- Prepare the reaction mix as follows by multiplying the number of N samples to test (including positive, IPC, negative controls). On average, prepare enough reagents for N+3 reactions minimum.
Number of reactions (N) | 1 | N+3 |
Premix | 18 µl | (N+3)x 18 µl |
RT N | 1 µl | (N+3)x 1 µl |
IPC | 3 µl | (N+3)x 3 µl |
Elution buffer | 12 µl | (N+3)x 12 µl |
Total volume of Reaction mix | 34 µl | (N+3)x 34 µl |
- Distribute 34 µl of the reaction mix with a micropipette and filtered sterile tips in each tube or well of a microplate for real time PCR.
- Add 12 µl of sample of extracted nucleic acid or RNA positive control for the positive control or Elution buffer for the negative control.
- Close immediately with an adhesive fillm to avoid all contamination
- Centrifuge briefly to collect all the PCR reaction mix at the bottom of the tubes or plate.
- Run the following Program on the qPCR instrument for the reverse transcription:
program | Temperature | duration | Cycle (s) |
Reverse transcription | 42°C | 30 min | 1 |
Number of reactions (N) | 1 | N+3 |
Taq N | 2 µl | (N+3)x 2 µl |
Elution buffer | 8 µl | (N+3)x 8 µl |
Total volume of Reaction mix | 10 µl | (N+3)x 10 µl |
- Run the following Program on the qPCR instrument for the PCR amplification:
program | Temperature | duration | Cycle (s) | Fluorescence acquisition |
DNA denaturation | 95°C | 5 min | 1 | |
Amplification | 95°C | 15 s | 42 | |
60°C | 40 s | yes | ||
Cooling* | 14.8°C | 2 min | 1 |
Controls | PRRS NA RNA control | IPC | Negative control |
FAM | <30 | >35 | |
VIC | <37 | >35 |
FAM signal (target) | VIC signal (IPC) | Presence of the target | Test validity/comment |
<35 | >37 | positive | |
<35 | <37 | positive | |
Not Ct or >35 | <37 | negative | valid |
Not Ct or >35 | Not Ct or >37 | inhibited | Possible inhibition of RT-PCR. Dilute ½ or 1/10 the extract, otherwise extract once again the sample and retest bt RT-PCR |
copies/PCR | Répétabilité intra expériementale | Reproductibilité inter experimentale |
1.55E+08 | 1.55 | 2.43 |
1.55E+07 | 0.17 | 1.92 |
1.55E+06 | 0.35 | 0.75 |
1.55E+05 | 0.38 | 0.31 |
1.55E+04 | 0.50 | 2.52 |
1.55E+03 | 0.64 | 1.31 |
7.76E+02 | 1.97 | 2.28 |
1.55E+02 | 2.28 | 4.40 |
7.76E+01 | 0.09 | 0.82 |
Moyenne CV | 0.88 | 1.86 |
- Analytical sensitivity: 3.38x101 copies/PCR for the PRRS NA virus
- Linearity for quantification: from 7.76x102 copies to 1.55x108 copies per PCR

kit | Channel | Efficacy | coefficient of correlation R² | Slope |
SDRP-NA | FAM | 126.04 % | 0.9941 | -2.83 |
- Brar M. S., Shi M., Murtaugh M. P., Leung F. C. (2015). Evolutionary diversification of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol. 96, 1570–1580.
- Dekkers J, Rowland RR, Lunney JK, Plastow G. Host genetics of response to porcine reproductive and respiratory syndrome in nursery pigs. Vet Microbiol. 2017 Mar 22
- Gillespie, J., Opriessnig, T., Meng, X.J., Pelzer, K., Buechner-Maxwell, V., 2009. Porcine circovirus type 2 and porcine circovirus-associated disease. J. Vet. Int. Med. 23, 1151–1163.
- Hansen, M.S., Pors, S.E., Jensen, H.E., Bille-Hansen, V., Bisgaard, M., Flachs, E.M., Nielsen, O.L., 2010. An investigation of the pathology and pathogens associated with porcine respiratory disease complex in Denmark. J. Comp. Pathol. 143, 120–131.
- Holtkamp DJ, Kliebenstein JB, Neumann EJ, et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J Swine Health Prod. 2013;21(2):72-84.
- Zimmerman JJ, Karriker L, Ramirez A, Schwartz K, Stevenson G. Diseases of Swine. Oxford: Wiley-Blackwell Publishing; 2012. pp. 461–462.