PRRS NA/HP detection kit – Semen (manual method-include extraction and purification)

Instruction Manual

Reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) in real time for the qualitative detection of

North America Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus

KIT HQS_PRRS-NA_i_tqm with IPC

48/96 reactions

The kit include and internal positive control

The kit uses the Taqman® probe technology to measure DNA/RNA amplification

Storage conditions:

Keep all reagents at -20 °C until use and after the first use.

Manufacturer ADNUCLEIS SAS Siret 497 802 165 000 17 TVA intraCEE : FR 3649780216500017 * 3 Route des Pierres Blanches F- 69290 GREZIEU LA VARENNE FRANCE

I.               Intended use The ADNUCLEIS North America Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) virus (HQS_PRRS-NA/HP_i_tqm) kit uses real time reverse transcriptase polymerase reaction (rt RT-PCR) amplification and is designed for the qualitative detection of North America Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus from a RNA nucleic acid extract. This kit also contains an internal positive control (IPC) of RT-PCR. The kit allows the early diagnosis of presumption of the North America PRRS virus from semen. I.               Intended use The ADNUCLEIS North America Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) virus (HQS_PRRS-NA/HP_i_tqm) kit uses real time reverse transcriptase polymerase reaction (rt RT-PCR) amplification and is designed for the qualitative detection of North America Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus from a RNA nucleic acid extract. This kit also contains an internal positive control (IPC) of RT-PCR. The kit allows the early diagnosis of presumption of the North America PRRS virus from semen. II.               Introduction Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is the most costly viral disease in the U.S. and around the world (Holtkamp et al.,2013). PRRS affects both the reproductive and grow-finish sectors of the pork industry through a decrease in reproductive health, an increase in mortality and morbidity, and reductions in the rate and efficiency of growth (Zimmerman et al., 2012). PRRS virus (PRRSV) also functions as a cofactor in other disease syndromes, such as porcine respiratory disease complex (PRDC) and PCV-associated disease (PCVAD) (Gillespie et al., 2009; Hansen et al., 2010, Dekkers et al, 2017). The annual cost in production-related losses of PRRS was estimated at $664 million in US in 2013 (+ 18% compare to 2005) (Holtkamp et al.2013). The PRRSV genome comprises a single, positive-sense, polycistronic RNA strand of approximately 15 kb. PRRS viruses are classified in two types:

• The type 1 was identified in Europe (EU) and the type 2 in North America in late 80’s. The two viruses cause similar syndrome, but their sequences revealed significant divergence (Brar 2015).
• The PRRS type 2 is subdivided in the two subtypes: the North American PPRS virus (NA) and the Hyper virulent PRRS virus (HP-PRRS) also called the Chinese PRRS virus. The HP-PRRS virus is genetically identical to the NA-PRRS virus except for a deletion of 30 amino acids in a non-structural protein (Nsp 2). The HP-PRRS virus was first discover in China.

Rev 1.0 (29/06/2017)

Boar semen samples should be kept between 1 and 4 °C or on ice until use. Raw semens are first diluted 1/10 in a buffer (Elixir buffer -genePro). 100 µl of the diluted semen are used for the nucleic acid extraction.

Rev 1.0 (27/06/2017)

Matériels et Réactifs fournis par ADNucleis :

• Un kit ADNUCLEIS d’extraction-purification d’ARN viral (kits d’extraction et kits de purification vendus séparément)
  • Kit d’extraction de l’ARN: Tampon d’extraction PVG à reconstituer
    • PVG (reconstituer le tampon d’extraction dans cette bouteille)
    • PE
    • TME
    • RNA carrier (Conserver à 4°C)

(Utiliser immédiatement une fois reconstitué). Kit de purification des acides nucléiques

• Billes Magnétiques en suspension (µMB)
• Tampon de précipitation SP
• Tampon de Lavage 1
• Tampon de Lavage 2
• Tampon de Lavage 3
• Tampon d’Elution (ELU)

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Matériels et réactifs nécessaires et non fournis

• Consommables et matériel
  • Plaque deep-well 96 puits (référence obligatoire pour robot : Ritter: Riplate plus PP 1mL ref. n°43001-0016).
  • Film aluminium pour plaque 96 puits
  • Film X percé.
  • kit de purification
  • Portoir aimanté ADNUCLEIS pour plaque deep-well

Le matériel ci-dessus n’est pas fourni dans le kit mais est disponible chez ADNucleis. Contacter ADNucleis pour les caractéristiques de ces consommables.

• Non-spécifiques et utilisés dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire: cônes, micropipettes (1mL, 200µL, 20 µl, 10 µl), Etuve stabilisée, bain-marie à 70°C, Bain-marie ou bloc chauffant, centrifugeuse à plaques, gants non poudrés…

• Eau ultrapure (stérile, distillée et nucléases-free).
• ARN Standard.

Etape 1 : Extraction de l'ARN

L’extraction de l’ARN est réalisée par lyse enzymatique et thermique, permettant ainsi la libération des molécules d’ARN de tous les microorganismes  et cellules présents dans l’échantillon. Reconstitution du tampon PVG :

• Resuspendre la poudre enzymatique PE avec le volume approprié de tampon TME (=ME) à la première ouverture du flacon PE. Homogénéiser.

Réactifs	Volume de TME
PE 25 mg	440 µl
PE 100 mg	1760 µl

Conserver à -20°C jusqu’à utilisation.

• Préparer extemporanément suffisamment de mix PVG + ME (100µL de PVG pour 4µL de ME) pour le nombre d’échantillons à extraire +3 (e.g. pour 20 échantillons préparer un mix d’extraction pour 23 échantillons).
• Le RNA carrier doit être ajouté au mix PVG + ME à cette étape. Ajouter 1 µl de RNA carrier par échantillon (e.g. 23 µl pour 23 échantillons)

Réactifs	1 réaction	24 réactions	48 réactions	72 réactions	96 réactions
PVG	100 µl	2700 µl	5100 µl	7500 µl	9900 µl
ME	4 µl	108 µl	204 µl	300 µl	396 µl
RNA carrier	1µl	27 µl	51 µl	73 µl	99 µl

Les volumes dans le tableau ci-dessus pour 24, 48, 72 et 96 réactions prennent en compte la perte de volume liée au pipetage (volume mort).

• Distribuer 100µl du réactif d’extraction PVG + ME + RNA carrier dans chaque puits de la plaque deep-well.
• Homogénéiser lentement l'échantillon puis ajouter 100µl dans le puits DeepWell
• homogénéiser par pipetage (3 fois).
• Placer alors la plaque DeepWell contenant les échantillons et PVG sur le bloc chauffant (type Thermoshaker) ou dans un bain marie
• Chauffer suivant les étapes ci-dessous

Temps	Température
42°C	20 min

A cette étape, les échantillons traités peuvent être stockés à 4°C. Si les échantillons ont été stockés à 4°C (72h maximum), ils doivent être chauffés 5 min à 56°C ± 10°C avant de passer à l’étape de purification.

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Etape 2 : Purification de l'ARN

Précautions préalables :

• Vérifier le pH du tampon d’élution (pH 8.5 +/-0.2) avant le préchauffage. Ajuster à l’aide d’acide chlorhydrique HCl dilué si nécessaire.
• Préchauffer le tampon d’élution à 70°C.
• Conserver la suspension de billes magnétiques à température ambiante et éloignée du portoir magnétique ou de toutes autres sources de champ magnétique.
• Une fois la purification effectuée, les puits utilisés peuvent être refermés avec un film adhésif (non fourni).
• Pour l’homogénéisation et pour enlever les surnageants et tampons d’élution, utiliser des cônes longs et fins permettant d'aller au fond du puits.
• Introduire verticalement les cônes dans les puits sans toucher les parois
• Régler la pipette multicanaux sur 200. Pour l’homogénéisation, placer les cônes verticalement dans le liquide et pipeter lentement pour éviter les éclaboussures. Les cônes doivent impérativement rester dans le liquide lors de l’homogénéisation pour éviter toutes éclaboussures. Ne pas faire de mousse.
• Homogénéiser lentement
• Lors du pipetage des surnageants et du tampon d’élution, placer les cônes verticalement et introduire dans les puits sans toucher les parois pour ne pas toucher l’amas de billes sur les côtés des puits. Les cônes peuvent être introduits jusqu’au fond des puits avec précaution en pipetant en même temps. Eliminer tout le surnageant.
• Changer de cônes pour chaque tampon et chaque échantillon.
• S’assurer que les cônes soient bien enfoncés sur la pipette. Vérifier la compatibilité des cônes avec la pipette.
• Vérifier visuellement que tous les cônes sur la pipette multicanaux présentent le même volume lors de l’aspiration. Une différence peut être due à un cône mal enfoncé, un cône non adapté à la pipette ou une pipette défectueuse

Étape de la purification :

• Ajouter 70 µl de solution SP (homogénéiser 4 fois par pipetage).
• Bien homogénéiser la suspension de billes magnétiques avant utilisation.
• Prélever 250 µl de suspension de billes magnétiques et les mettre dans chaque puits. Mélanger la suspension de billes magnétiques de temps en temps si vous remplissez une plaque entière.
• Homogénéiser délicatement la solution de billes magnétiques avec l’échantillon par pipetage avec la pipette multicanaux. Faire 3 ou 4 allers-retours. Utiliser un cône différent pour chaque puits.
• Incuber 2 minutes à température ambiante.
• Placer les tubes sur le portoir magnétique pendant 2 minutes. Les billes magnétiques sont capturées sur le côté de chaque puits pour former un amas noir. (Prolonger 1 minute supplémentaire dans le cas de difficulté d’aimantation des billes magnétiques, ce phénomène peut être visible avec des matrices très grasses).
• Éliminer le surnageant avec une pipette multicanaux et des cônes de 250 µl. Pour cela introduire les cônes verticalement dans les puits sans toucher les parois et aspirer le surnageant sans aspirer les billes magnétiques en gardant la plaque sur l’aimant. Aspirer tout le surnageant au fur et à mesure de l’enfoncement du cône d’aspiration en allant jusqu’au fond des puits. L’élimination du surnageant peut se faire en deux fois.
• Ôter la plaque de l’aimant.
• Ajouter 250µl de tampon de lavage 1, homogénéiser délicatement par aspiration-refoulement avec la pipette multicanaux réglée sur 200 µl (voir schéma ci-dessous). Faire 6 allers-retours, puis incuber 1 minute à température ambiante.
• Placer les tubes sur le portoir magnétique pendant 1 minute. Les billes magnétiques sont capturées sur un côté de chaque puits pour former un amas noir. Prolonger d’une 1 minute supplémentaire dans le cas de difficulté d’aimantation des billes magnétiques, ce phénomène peut être visible avec des matrices très grasses.
• Eliminer le surnageant avec une pipette multicanaux et des cônes de 250 µl. Pour cela introduire les cônes verticalement dans les puits sans toucher les parois et aspirer le surnageant sans aspirer les billes magnétiques en gardant la plaque sur l’aimant. Aspirer tout le surnageant au fur et à mesure de l’enfoncement du cône d’aspiration en allant jusqu’au fond des puits. L’élimination du surnageant peut se faire en deux fois.Ôter la plaque du portoir magnétique.
• Ôter la plaque du portoir magnétique
• Ajouter 250µl de tampon de lavage 2: homogénéiser, incuber 1 minute à température ambiante, placer les tubes sur le portoir magnétique pendant 1 minute.
• Eliminer le surnageant par pipetage en deux fois si nécessaire en gardant la plaque sur l’aimant.
• En gardant la plaque sur le portoir aimanté, ajouter 300µl de tampon de lavage 3. Ne pas homogénéiser. Incuber 1 minute à température ambiante, puis éliminer la totalité du lavage 3. Pipeter une 2^ème fois si nécessaire pour éliminer la totalité du surnageant.
• S’assurer visuellement de l’absence de tampon de lavage 3.
• Ôter la plaque du portoir magnétique.
• Ajouter 150 µl de tampon d’élution préchauffé à 70°C, remettre en suspension délicatement les billes magnétiques par aspiration-refoulement avec la pipette multicanaux (voir schéma ci-dessous).
• Incuber 2 min à 70°C la plaque pour l’élution de l’ARN.
• Placer la plaque sur le portoir magnétique pendant 1 minute, pipeter 145 µl de surnageant en évitant de prendre des billes magnétiques et transférer l’éluât dans des microtubes propres.
• Si des billes magnétiques ont été pipetées, centrifuger 5 min à 500 g les tubes contenant l’éluât et transférer le surnageant dans des nouveaux tubes sans prendre les billes magnétiques.

L’ARN purifié peut être utilisé directement en amplification par PCR ou toute autre application de biologie moléculaire. L’ARN extrait peut être conservé à -20°C pendant une longue période. Homogénéiser les ARN extraits avant utilisation.Pour toutes questions techniques, contacter ADNUCLEIS contact@adnucleis.com  

III.               Principle of the detection The ADNUCLEIS RT-PCR kits are using reverse transcription to synthesize RNA into cDNA followed by the amplification of the cDNA by real time RT- PCR. Kits may also include  inhibition control (IPC) made of synthetic RNA. This control ensures that a negative result may not be due to the presence of PCR inhibitors at high quantity. The test is performed from the RNA extracted from the sample. For taqman duplex kits with IPC, the target is usually detected by  the FAM channel and the IPC by the JOE/VIC channel (color Probe may be different, please refer to the kit certificat for further information). All emit at a specific fluorescence following its hydrolysis during the elongation of the amplification product. The measurement of the intensities of the real time fluorescence relates the accumulation of specific amplification products. This amplification system has been validated on:

• A synthetic RNA produced in vitro from a plasmid containing a specific insert of the target or of the IPC.

IV.               Description and content of the kit The PRRS NA virus real time RT-PCR kit is ready to use for the specific detection of the type 2 (NA/HP) PRRS virus. The kit contains reagents and enzymes necessary of the amplification of type 2 (NA/HP) PRRS virus, synthetic PRRS NA RNA (positive control) and of RNA control (IPC) of RT-PCR inhibition (see table 1). Fluorescence is emitted and measured individually by an optical system during PCR. The detection of the amplified fragment is carried out by the fluorimeter using the channels listed in table 2.   Table 1:

Components of the kits	48 reactions	96 reactions	Reconstitution
	Volume (µl)	Volume (µl)
PCR pre-mix	1160	2000	Ready to use
Taq polymerase Nucleis (Taq N)	116	200	Ready to use
Reverse transciptase Nucleis (RT N)	58	100	Ready to use
PRRS NA RNA Positive control	200	200	Ready to use
RNA IPC (inhibitory control)	150	300	Ready to use

  Table 2

Target	Fluorophore	Excitation	Emission
PRRS NA virus	FAM	499	519
IPC	VIC	520	548

  Alternatives: -channel FAM: (ABI Systems, smartcycler II; Chromo 4/CFX96, System Agilent MX and aria, realplex), channel 530 (LC480), channel Green (RotorGene) -channel VIC: Channel VIC (ABI systems, Biorad CFX96, Agilent Mx and aria, realplex), channel Alexa 532 (Smart cyclerII), Channel 560 (LC 480); channel Yellow  (RotorGene)   Required material and reagents not provided

• Elution buffer
• A RNA extraction and purification kit
• Biological hood
• qPCR instrument
• Micro centrifuge
• Vortex
• Plates / tubes for qPCR
• Micropipettes
• Filtre tips for micropipettes
• Sterile microtubes
• A viral RNA extraction and purification kit
• Non powdered gloves

V.               Storage All reagents must be stored at -20°C. Storage at 4°C is forbidden. All reagents can be used until the expiration date indicated on the kit Many freezing/thawing cycles (>3x) must be avoided, could lead to decrease in sensitivity VI.               Cautions and notes

• Read carefully instructions before starting.
• The experiment must be performed by competent staff
• Instruments must have been properly installed, calibrated and maintained according to the manufacturer’s recommendations
• Clinical samples are potentially infectious and must be processed under a laminar flow hood/
• The experiment must be performed according to good laboratory practices
• Do not use this kit after expiration date
• Many freezing/thawing cycles of the reagents must be avoided, and could lead to decrease of sensitivity
• Once defrosted, spin down briefly the tubes before use
• Spin down briefly enzymes tubes to pellet the viscous content at the bottom of the tubes.
• Use of ice or cooling block is mandatory to prepare the mix and dispense reconstituted mix in wells.
• Define 3 working areas: 1)Isolation of DNA/RNA, 2) Preparation of the reaction mix and 3) Amplification/detection of amplified products.
• Pipettes, reagents and other materials must not cross each area
• Specific caution is required to preserve the purity of the reagents and reaction mixtures. The use of gloves is mandatory. Appropriate methods of preparation of DNA should be used.
• Always use filtered tips for micropipettes
• Use specific lab coat and gloves in each working area
• Do not pipette with mouth and do not eat, drink or smoke in the area
• Avoid sprays

VII.               Collection of samples, transport and storage

• Collect samples in sterile tubes
• The samples should be extracted immediately or frozen from -20°C to 80°C
• Transport of clinical samples must obey local regulations for this type of infectious agents.

VIII.               Procedure VIII.1   RNA/DNA extraction RNA/DNA extraction kits are available from ADNUCLEIS. For semen samples, the RNA extraction kit and RNA/DNA purification kit of ADNUCLEIS is recommended. The RNA IPC on the Vic channel added to the RT-PCR reaction ensures that a negative result is not due to the presence of high amount of RT-PCR inhibitors. In that case, 3 µl of RNA IPC is added per reaction. VIII.2   Q RT-PCR General comment: Positive control contains a high concentration of nucleic acids. Manipulations must be performed carefully to avoid contamination. It is necessary to test the positive control PRRS NA RNA (12 µl in final volume of 52 µl reaction), as well as a negative control (elution buffer, supplied separately). RNA IPC is added in each RT-PCR well (3µl) or in the reconstituted mix at the appropriate volume (3 µl * number of reaction prepared). Example of qualitative real time RT-PCR plate  

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	Positive control + IPC
B	IPC
C	Negative control
D	Sample 1 + IPC
E	Sample 2 + IPC
F	…
G
H

Positive control: PRRS NA synthetic RNA IPC: synthetic RNA to control inhibition properties of the sample. VIII.3   Real time RT-PCR protocol The Reverse transcriptase reaction is performed before the PCR. The Taq N polymerase is added after the reverse transcriptase reaction is performed.  

• Homogenize gently the premix tube before starting and spin down brief the premix tubes, enzymes tubes and control tubes.
• Prepare the reaction mix as follows by multiplying the number of N samples to test (including positive, IPC, negative controls). On average, prepare enough reagents for N+3 reactions minimum.

Number of reactions (N)	1	N+3
Premix	18 µl	(N+3)x 18 µl
RT N	1 µl	(N+3)x 1 µl
IPC	3 µl	(N+3)x 3 µl
Elution buffer	12 µl	(N+3)x 12 µl
Total volume of Reaction mix	34 µl	(N+3)x 34 µl

 

• Distribute 34 µl of the reaction mix with a micropipette and filtered sterile tips in each tube or well of a microplate for real time PCR.
• Add 12 µl of sample of extracted nucleic acid or RNA positive control for the positive control or Elution buffer for the negative control.
• Close immediately with an adhesive fillm to avoid all contamination
• Centrifuge briefly to collect all the PCR reaction mix at the bottom of the tubes or plate.
• Run the following Program on the qPCR instrument for the reverse transcription:

 

program	Temperature	duration	Cycle (s)
Reverse transcription	42°C	30 min	1

  Once the reverse transcription is done, the Taq N is added into each well. Dilute the Taq N as follows by multiplying the number of N sample to test ( including positive, IPC, negative controls). On average, prepare enough reagents for N+3 reactions minimum.

Number of reactions (N)	1	N+3
Taq N	2 µl	(N+3)x 2 µl
Elution buffer	8 µl	(N+3)x 8 µl
Total volume of Reaction mix	10 µl	(N+3)x 10 µl

  Distribute 10 µl of the diluted Taq N with a micropipette and filtered sterile tips in each tube or well of a microplate for real time PCR.

• Run the following Program on the qPCR instrument for the PCR amplification:

program	Temperature	duration	Cycle (s)	Fluorescence acquisition
DNA denaturation	95°C	5 min	1
Amplification	95°C	15 s	42
	60°C	40 s		yes
Cooling*	14.8°C	2 min	1

*temperature of the cooling step can vary according to the qPCR instrument. Please contact ADNUCLEIS for further information. Note 1: set heating and cooling rate by default, up to 20°C/sec, or 100 % Note 2: For Applied Biosystems, select “none” in “Passive reference”. Note 3: n RotorGene, please calibrate the signal by clicking n “GAIN OPTIMIZATION” IX.               Validation of the experiment For the assay to be valid, the Ct values for the controls must be the following. Outside of these values, the experiment is not valid.

Controls	PRRS NA RNA control	IPC	Negative control
FAM	<30		>35
VIC		<37	>35

X.               Data analysis and interpretation For clinical samples, the following results are possible:

FAM signal (target)	VIC signal (IPC)	Presence of the target	Test validity/comment
<35	>37	positive
<35	<37	positive
Not Ct or >35	<37	negative	valid
Not Ct or >35	Not Ct or >37	inhibited	Possible inhibition of RT-PCR. Dilute ½ or 1/10 the extract, otherwise extract once again the sample and retest bt RT-PCR

XI.               Performances analysis XI.1        Studies of repeatability and reproducibility Studies of repeatability and reproducibility of the kit ADNUCLEIS PRRS NA virus have been achieved using a synthetic RNA by in vitro transcription on a plasmid containing a fragment of the PRRS NA virus. The tables below indicate the coefficient of variation (CV) depending on the concentration of the RNA   Table of Repeatability (intra-experiment) and reproducibility (inter-experimental)

copies/PCR	Répétabilité intra expériementale	Reproductibilité inter experimentale
1.55E+08	1.55	2.43
1.55E+07	0.17	1.92
1.55E+06	0.35	0.75
1.55E+05	0.38	0.31
1.55E+04	0.50	2.52
1.55E+03	0.64	1.31
7.76E+02	1.97	2.28
1.55E+02	2.28	4.40
7.76E+01	0.09	0.82
Moyenne CV	0.88	1.86

  XI.2        Performance analysis

• Analytical sensitivity: 3.38x10¹ copies/PCR for the PRRS NA virus
• Linearity for quantification: from 7.76x10² copies to 1.55x10⁸ copies per PCR

*average Ct are calculated with the three replicates

kit	Channel	Efficacy	coefficient of correlation R²	Slope
SDRP-NA	FAM	126.04 %	0.9941	-2.83

*average efficacy, R² and slope are calculated with the three replicates     XII.               Biobliography

• Brar M. S., Shi M., Murtaugh M. P., Leung F. C. (2015). Evolutionary diversification of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol. 96, 1570–1580.
• Dekkers J, Rowland RR, Lunney JK, Plastow G. Host genetics of response to porcine reproductive and respiratory syndrome in nursery pigs. Vet Microbiol. 2017 Mar 22
• Gillespie, J., Opriessnig, T., Meng, X.J., Pelzer, K., Buechner-Maxwell, V., 2009. Porcine circovirus type 2 and porcine circovirus-associated disease. J. Vet. Int. Med. 23, 1151–1163.
• Hansen, M.S., Pors, S.E., Jensen, H.E., Bille-Hansen, V., Bisgaard, M., Flachs, E.M., Nielsen, O.L., 2010. An investigation of the pathology and pathogens associated with porcine respiratory disease complex in Denmark. J. Comp. Pathol. 143, 120–131.
• Holtkamp DJ, Kliebenstein JB, Neumann EJ, et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J Swine Health Prod. 2013;21(2):72-84.
• Zimmerman JJ, Karriker L, Ramirez A, Schwartz K, Stevenson G. Diseases of Swine. Oxford: Wiley-Blackwell Publishing; 2012. pp. 461–462.

XIII.               Waste disposal Dispose of waste according to DASRI regulations