Modification des qualités organoleptiques par les Levures, Moisissures, Bactéries.

Détection rapide par PCR : une révolution pour l’agro alimentaire

Par Y_tambe — Y_tambe’s file, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=1527577

A ce jour, la méthode industrielle de référence utilisée pour la mise en évidence d’une contamination fongique (moisissures et levures) est habituellement basée sur la culture microbiologique. Elle consiste généralement à faire un étalement sur boite de Pétri contenant la gélose Sabouraud additionnée de Chloramphénicol et incubée à 28°C pendant 3 à 7 jours au total,. La boite est ensuite interprétée par identification visuelle des colonies et par comptage de colonies.

La PCR Quantitative (Quantitive Polymerase Chain Reaction (qPCR)) est une autre technique d’isolement ; elle permet l’amplification spécifique de séquences d’ADN. L’utilisation d’un fluorophore permet la détection et la quantification d’une faible quantité d’ADN de départ (moins de 10 copies).


L’utilisation de cette technique en industrie agroalimentaire pour l’identification de microorganismes contaminants est en hausse grâce à son avantage majeur qui est la rapidité. En effet, les résultats de l’amplification de l’ADN cible recherché sont obtenus en moins de trois heures permettant un gain important de temps et ainsi une rapide mise en place de mesures correctives nécessaires.

Pour les industriels, les avantages de cette analyse de 3 heures versus 5 à 7 jours sont extrêmement impactants :

  • une mesure en temps réel des taux de contamination sur la zone de production
  • la possibilité de faire un contrôle des matières premières entrantes
  • la possibilité de faire une analyse dite libératoire, dont le résultat permettrait donc l’accord pour la livraison au réseau de distribution


AD Nucléis a mis en place une PCR quantitative pour la détection des contaminants de différentes matrices agro alimentaires par des microorganismes de types levures et moisissures en lieu et place des essais microbiologiques.

Phylogénie des champignons

Le règne des champignons/moisissure est un groupe polyphylétique eucaryote aux écosystèmes et métabolismes extrêmement variés qui s’organise selon l’arbre rapporté dans le tableau 1 (Spatafora et al., 2017). L’homme les a d’abord séparés en macro et micromycètes, ceux visibles à l’œil nu et ceux visibles en microscopie, mais les méthodes moléculaires récentes ont permis d’analyser plus finement les relations de parenté entre les différents clades constituant ce règne.

Les levures sont retrouvées tant chez les ascomycètes que chez les basidiomycètes. Notamment, Saccharomyces cerevisiae ou « levure de boulanger », est un ascomycète appartenant à la classe des Saccharomycetes et à la famille des Saccharomycetaceae.

 Tableau 1 : Arbre phylogénétique de l’ordre des champignons selon (Spatafora et al., 2017)

Inclusivité

AD Nucléis dispose de 3 kits à spectre large : Le kit Candida spp, le kit levure et le kit moississure/levure (fungi/yeast).

Les spécificités in silico de ces kits varient en fonction des amorces et sondes choisies.

  • Le kit candida spp permet la détection des espèces appartenant au genre candida. La liste ci-dessous montrent un panel des espèces détectées in silico à partir des séquences publiées. Cette liste n’est pas exhaustive : Candida albicans, Candida parapsilosis, candida tropicalis, candida viswanathi, candida dubliniensis, candida sake, Pichia kudriavzevii, Pichia fermentans, Pichia kluyveri. Bretanomyces
  • Le kit levure permet la détection d’un large spectre d’espèces de levures et moisissures. La liste ci-dessous montrent un panel des espèces détectées in silico à partir des séquences publiées. Cette liste n’est pas exhaustive :
    Candida boidinii, Candida sake, Candida stellata, ,Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia terricola, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycodes ludwigii, Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces rouxii
  • Le kit fungi/yeast permet la détection d’un large spectre d’espèces de champignons unicellulaires et de levures. La liste ci-dessous montrent un panel des espèces détectées in silico à partir des séquences publiées. Cette liste n’est pas exhaustive :
    Debaryomyces hansenii, Lodderomyces elongisporus, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Acremonium strictum, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulans, Chaetomium globosum, Elaphomyces decipiens, Exophiala dermatitidis, Fusarium equiseti, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Microsporum canis, Neurospora crassa, Paecilomyces lilacinus, Paecilomyces sinensis, Paecilomyces variotii, Penicillium marneffei, Scedosporium apiospermum, Sporothrix schenckii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Candida famata, Candida guilliermondii, Candida haemulonii, Candida intermedia, Candida quercitrusa, Candida tropicalis, Geotrichum candidum, Pichia ohmeri, Saccharomycopsis crataegensis, Stephanoascus ciferrii, Absidia corymbifera, Cunninghamella bertholletiae, Rhizopus microspores, Rhizopus oryzae, Alternaria sp., Cladosporium cladosporioides, Cytospora chrysosperma, Endoconidioma sp., Geopora sp., Phoma herbarum, Xanthomendoza galericulata, Agaricus sp., Clavulina coralloides, Coprinus sp., Cortinarius sp., Hebeloma crustuliniforme group, Melanogaster sp., Pleurotus ostreatus, Rhizopogon sp., Sclerogaster xerophilus, Sedecula pulvinata, Tricholoma populinum, Trichosporon asahii, Trichosporon asteroides, Trichosporon cutaneum, Trichosporon dermatis, Trichosporon faecale, Trichosporon montevideense, Trichosporon mucoides, Trichosporon ovoides, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula slooffiae

Ces listes ne sont pas exhaustives. L’adéquation des kits pour la détection d’une espèce données doit être vérifiée au niveau des séquences génomiques et/ou par des tests de qPCR sur des souches caractérisées.

Nota : à côté des contaminants du type levures dans des produits de consommation courante, on recherche aussi fréquemment des bactéries du type Acetobacter, Alicyclobacter, Clostridium, Leuconostoc, Gluconobacter, Lactobacillus, Saccharobacter, Zymobacter, Zymomonas, Bacillus, dont le rôle pathogène est faible mais ils sont en général inducteurs de modifications organoleptiques particulièrement désagréables, notamment dans les boissons du type jus de fruit. Mais il s’agit de bactéries isolées par ARN16S ou par un procédé plus spécifique visant une des bactéries citées.

Une détection rendue accessible grâce à des automates tout en un réalisant l’analyse PCR

Le Sequence Pro est un de ceux-là. Il offre la capacité de réaliser rapidement, et sans compétences techniques en biologie moléculaire, une analyse PCR temps réel car il cumule les fonctions de l’extraction et purification de l’ADN, la préparation de puits PCR et l’amplification PCR temps réel à proprement parler. Différentes matrices alimentaires peuvent y être insérées moyennant pour les plus complexes d’entre elles une courte préparation de l’échantillon. L’appareil est fait pour réaliser quelques dizaines d’analyses par jour.

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