Extraction – purification d’ARN 100- méthode robotisée (96R Ext_ARN PVG100+ Purification BM)

Rev 1.1 (14/03/2017)

Matériels et Réactifs fournis par ADNucleis :

  • Un kit ADNUCLEIS d’extraction-purification d’ARN viral (kits d’extraction et kits de purification vendus séparément)
    • Kit d’extraction de l’ARN: Tampon d’extraction PVG à reconstituer
      • PVG (reconstituer le tampon d’extraction dans cette bouteille)
      • PE
      • TME
      • RNA carrier (Conserver à 4°C)

(Utiliser immédiatement une fois reconstitué).

 

  • Kit de purification des acides nucléiques
    • Billes Magnétiques en suspension (µMB)
    • Tampon de précipitation SP
    • Tampon de Lavage 1
    • Tampon de Lavage 2
    • Tampon de Lavage 3
    • Tampon d’Elution (ELU)
    • Tampons de décontaminations des aiguilles de l’automate pipeteur D1, D2 et D3

Matériels et réactifs nécessaires et non fournis

  • Consommables
    • Plaque deep-well 96 puits (pour l’option Robot, utiliser la marque Ritter: Riplate plus PP 1mL ref. n°43001-0016).
    • Film aluminium pour plaque 96 puits.

Le matériel ci-dessus qui n’est pas fourni dans le kit mais est disponible chez ADNucleis. Contacter ADNucleis pour les caractéristiques de ces consommables.

  • Non-spécifiques et utilisés dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire: cônes, micropipettes (1mL, 200µL, 20 µl, 10 µl), gants non poudrés…
  • Eau ultrapure (stérile, distillée et nucléases-free).
  • ARN Standard.

 

 


L’extraction de l’ARN est réalisée par lyse enzymatique et thermique, permettant ainsi la libération des molécules d’ARN de tous les microorganismes  et cellules présents dans l’échantillon.

Reconstitution du tampon PVG :

  • Resuspendre la poudre enzymatique PE avec le volume approprié de tampon TME (=ME) à la première ouverture du flacon PE. Homogénéiser.
Réactifs Volume de TME
PE 25 mg 440 µl
PE 100 mg 1760 µl

Conserver à -20°C jusqu’à utilisation.

  • Préparer extemporanément suffisamment de mix PVG + ME (100µL de PVG pour 4µL de ME) pour le nombre d’échantillons à extraire +3 (e.g. pour 20 échantillons préparer un mix d’extraction pour 23 échantillons).
  • ATTENTION A BIEN HOMOGENEISER LE PVG : aucun volute ne doit apparaître (10 aspirations refoulement en moyenne).
  • Le RNA carrier doit être ajouté au mix PVG + ME à cette étape. Ajouter 1 µl de RNA carrier par échantillon (e.g. 23 µl pour 23 échantillons)

 

Réactifs 1 réaction 24 réactions 48 réactions 72 réactions 96 réactions
PVG 100 µl 2700 µl 5100 µl 7500 µl 9900 µl
ME 4 µl 108 µl 204 µl 300 µl 396 µl
RNA carrier 1µl 27 µl 51 µl 73 µl 99 µl

Les volumes dans le tableau ci-dessus pour 24, 48, 72 et 96 réactions prennent en compte la perte de volume liée au pipetage (volume mort). ADN_SOFT prend en compte par défaut ces volumes recalculés.

  • Distribuer 100µl du réactif d’extraction PVG + ME +RNA carrier dans chaque puits de la plaque deep-well.
  • Pour le ROBOT Pipeteur, la distribution est faite colonne par colonne en commençant par la première (A1, B1…H1, A2, B2…H2 etc.).

       

 

  • Il est possible de démarrer avec un décalage (Offset) mais en conservant alors toujours l’ordre de haut en bas puis changement de colonne de gauche à droite sans puits vides. Le numéro d’offset apparaît après avoir cliqué sur “Plate Layout” :

  • Homogénéiser lentement l’échantillon puis ajouter 100µl dans le puits DeepWell (semence diluée ou sang).
  • Vortexer ou homogénéiser par pipetage.
  • Placer alors la plaque DeepWell contenant les échantillons et PVG sur le bloc chauffant (Thermoshaker)
  • Démarrer ADN_SOFT.exe (“START A NEW RUN”), faire immédiatement “Save As..” et enregistrer votre archive dans le dossier dédié par défaut.
  • Compléter le plan de plaque. Cliquer ensuite sur “Lock Layout”.
  • Préciser le volume de tampon d’élution d’ARN désiré qui sera demandé par le robot
  • Le tableau suivant indique les volumes de réactifs à préparer sur le robot. Le protocole concerné pour l’extraction-purification par microbilles est “µMB Extract-Purif” :

  • Bien vérifier le volume de système liquide (2%D3 dans de l’eau déminéralisée), vider la bonbonne “Waste”
  • Démarrer ensuite Gemini (le logiciel qui pilote le robot TECAN), puis ouvrir le programme  ADNucleis_Extract_Purif.gem
  • Remplir les bacs de réactifs en concordance de position indiqués sur le plan de travail sur Gemini (les volumes étant renseignés sur ADN_SOFT.
  • Installer une plaque DeepWell vierge sur “DW-Empty”, cette dernière contiendra les ARN élués en fin de protocole d’extraction-purification.
  • Allumer le bloc Inheco Multitec. Le programme du robot (Gemini) réalisera les consignes de température et d’homogénéisation automatiquement durant le run.
  • Sur Gemini, faire un “flush”

  • Puis initialiser le robot.

  • Sur Gemini, cliquer alors sur “Play” pour lancer le programme. Celui-ci va demander le nombre d’échantillons à extraire.

NB : le robot commence par la lyse thermique, il n’y aura donc aucun mouvement durant 30mn.

  • A la fin du programme (environ 30mn + 1mn / échantillon) L’ARN élué sera ensuite disposé sur le thermoshaker qui sera programmé à 4°C.
  • retourner ensuite sur ADN_SOFT de façon à établir le “setup” de la plaque PCR.

Préparation d’échantillon – semences

Rev 1.1 (22/06/2017)

 

Les échantillons de semence de porc doivent être conservés l à 4°C ou sur glace jusqu’à utilisation. 100µl sont nécessaire pour l’extraction.

Utilisation et métrologie de l’automate

Avant chaque Run

  • Nettoyer de haut en bas les aiguilles avec un tissu imbibé d’ethanol
  • Nettoyer le plan de travail avec une lingette
  • Enlever les éventuels encombrants.
  • Vérifier la tuyauterie :
    • les 2 tuyaux de la bonbonne Liquid System (le tuyau d’aspiration doit être immergé, le second tuyau est un tuyau de surpression qui lui peut être immergé ou non),
    • ainsi que le tuyau de la bonbonne de vidange qui doit bien être raccordé.
  • Au démarrage, remplir au préalable la bonbonne Liquid System, et vider la bonbonne Waste
  • Bien vérifier l’absence totale de bulles d’air au niveau des 8 tuyaux surplombant les 8 aiguilles (au dessus du bras pipeteur). Si de l’air est présent, cliquer sur la commande “Flush” jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’air. Vérifier que le tuyau d’aspiration de liquide est bien immergé.
  • Vérifier, dès le premier flush du système, si les 8 seringues sont bien entraînées par les diluteurs de haut en bas (possible désolidarisation du piston de la seringue, auquel cas, resserrer fermement).
  • Re générer la plaque PCR (Create PCR plates)
  • Re générer le code robot (Generate Code)

 

Après chaque Run

Nettoyer les bacs 100ml :

  • Concernant le bac des microbilles de silicium, si les microbilles restent collées au fond, il peut être nécessaire de les décoller avec le tampon D2.

  • Pour tous les bacs, possibilité de les décontaminer avec 2.5% d’hypochlorite de sodium (remplir 10 ml pendant 2 minutes), puis les laver à 55°C maximum.  [/su_spoiler]

 

Toutes les semaines

Effectuer un test gravimétrique avec le programme ADNucleis_GRAVIMETRIE.gem.

Les volumes désirés en 100µl et en 18µl peuvent être mesurés par une pipette. Une tolérance de variation de 5% pour les volumes 100µl est admise, une tolérance de variation de 10% pour les volumes en 18µl est admise concernant les protocoles ADNucleis.

Tous les mois

Le thermoshaker contient un liquide de refroidissement dont il convient de vérifier le niveau tous les mois :

  • dévisser tout d’abord les 2 vis à l’aide d’une clé allen

  • Monter la seringue avec le support intermédiaire :

 

  • Aspirer le liquide fourni par Inheco (THERMOSHAKE COOLING LIQUID) et remplir le thermoshaker jusqu’à le voir à fleur du réservoir.

 

Dépannage Robot 8-150 RoMa

« Device is not implemented”, arrivant durant l’initialisation du robot 

  • Cause : Erreur peut être causée par une mauvaise position mécanique initiale.
  • Tâche corrective : Eteindre le robot, déplacer en x, y et z le bras manipulateur et déplacer le bras pipeteur. Rallumer ensuite le robot, éteindre et rallumer Gemini pour relancer l’initialisation.

 


Diluter error “Plunger overload”

  • Cause : Cette erreur indique que l’aiguille est bouchée ou encore que le diluteur est endommagé (en cas d’erreur répétée+1 fois / 5 runs)

 

  • Tâche corrective : Le robot est en arrêt jusqu’à ce que l’opérateur clique sur “initialize”. Une fois réinitialisé, le robot peut reprendre le run. Si le robot échoue à la réinitialisation, éteindre le robot, vérifier si l’aiguille est bouchée (éventuellement la passer au sonicateur 5mn avec de l’eau déminéralisée et 2% D3). Déplacer légèrement le diluteur en haut et en bas (via le support inférieur qui maintient la seringue. Rallumer le robot et réinitialiser.

Si le problème survient plus d’une fois chaque 5 runs sur un même canal, le diluteur doit être changé. Pour changer le diluteur, la procédure est la suivante : 

  • 0- Éteindre et débrancher le robot. Mettre les bras au centre du robot de façon à pouvoir soulever le capot du robot.
  • 1- Dévisser le support inférieur de la seringue
  • 2- Déplacer vers le bas le support désolidarisé
  • 3- Dévisser la seringue, l’installer sur un nouveau diluteur
  • 4- Dévisser les 2 tubes au dessus de la vanne 3 voies. Attention au liquide system qui peut couler et endomager les composants electroniques (placer une lingette pour sécuriser).
  • 5- Vérifier SOUS le diluteur si une vis maintient le diluteur, si tel est le cas, la devisser.
  • 6- Retirer le diluteur de son branchement en le tirant vers soi.
  • 7- Vérifier l’adressage numérique sur la face arrière du diluteur et reporter ce même adressage sur le nouveau diluteur à l’aide d’un tournevis plat.
  • 8- Installer le nouveau diluteur.
  • 9- Visser fermement les tubes et seringues à la main, et enfin le support inférieur de la seringue.
  • 10- Démarrer le robot, démarrer Gemini et initialiser. Si une erreur survient, vérifier si l’adressage numérique est bien correct.


Diluter error “tip is broken”

  • Cause  : Ce problème peut arriver lorsque une mauvaise opération de dispense a été effectuée. Le robot ou l’opérateur a désactivé le canal.
  • Tâche corrective : Setup -> Configuration -> LiHa -> corriger la cellule où le canal (tip) est marqué comme “broken”.
  • Traitement de la cause du problème : contacter ADNucleis support@adnucleis.com

Gouttes sur aiguille (supérieur 1 goutte / minute)

  • Peut être causé par :
  1. Le tube à l’intérieur de la bonbonne Liquid System est désolidarisé et n’est plus immergé.
  2. Plus assez de liquide dans la bonbonne. Un symptôme peut être l’apparition de bulles d’air visibles dans les tuyaux au dessus du bras pipeteur.
  3. Les vis de la seringue et de la vanne 3 voies ne sont pas assez serrées.

 

  • Tâche corrective :
    • Vérifier tout d’abord les serrages (serrage manuel SANS outil)
    • Concernant le 1er et second cas, remplir la bonbonne liquid system (et vider la bonbonne Waste). ATTENTION, le robot contient dans ce cas de l’air (bulles d’air) dans ses tuyaux. Il sera nécessaire d’effectuer  2 flush de façon à éliminer totalement les bulles d’air si des bulles sont présentes dans les tuyaux


Detection error “no liquid”

  • Causes probables :
  1. Pas assez de liquide dans le tube ou bac à pipeter.
  2. Liquide déionisé dans le bac donc impossibilité pour le robot de détecter le liquide.
  3. ADN_SOFT a sous estimé le volume nécessaire, dans ce cas, contacter  support@adnucleis.com
  4. Évaporation du liquide car trop de temps écoulé entre la mise en place des réactifs et le run lui-même.

 

  • Tâche corrective : Ajouter le réactif concerné dans le bac jusqu’à ce que la détection se fasse et cliquer sur “Retry Detection”.

NB : A partir de 5ml sur un bac 100ml, le robot est sensé le détecter. Si le volume nécessaire est néanmoins présent, forcer l’aspiration en cliquant sur“Move tips to Zmax

 

Si le problème survient fréquemment notamment sur un canal particulier, le détecteur est endommagé. Il reste possible de finir le run en cliquant systématiquement sur “Move To Zmax”. Pour changer le câble ILID, éteindre et débrancher le robot. Démonter le capot gauche du bras pipeteur, démonter le câble ILID concerné et le remplacer par un neuf.

 

Automatisation de l’extraction et purification et préparation de plaques PCR

Les protocoles d’extraction et purification de ADNucleis sont compatibles avec la plupart des plateformes robotiques de pipetage du marché, et ce avec tous les avantages de la robotisation : répétabilité des opérations, qualité et traçabilité.
Au choix : technique plus rapide avec cônes (1 minute 30 par échantillon) ou plus avantageuse économiquement, sans cône avec protocole de décontamination des aiguilles (3 minutes par échantillon)

Ce protocole est compatible avec les grandes séries (jusqu’à 100 000 extractions par an par appareil).

ADNucleis fournit les protocoles pour l’extraction purification par microbilles de silicium ou par colonnes, ainsi que pour effectuer la préparation de plaques PCR.

Nos outils logiciels permettent à l’opérateur d’opérer simplement aisément la préparation des échantillons pour 1 à 3 plaques d’ADN ou ARN extraits en entrée et 1 à 3 plaques PCR en sortie.

la PCR temps réel comme technique alternative aux méthodes culturales traditionnelles sur boîtes de Pétri

La PCR temps réel est reconnue pour permettre l’isolation, l’identification et la quantification de l’ADN des bactéries, virus, parasites, allergènes, OGM en un temps très court de l’ordre de 1 à 3h dans tous les domaines: hygiène alimentaire, santé animale et/ou santé humaine.

Longtemps restreinte pour des raisons de prix  à la détection de quelques pathogènes en hygiène alimentaire, aux produits à faible durée de vie,  l’objectif du Professeur Michel Franck, PDG de ADNucleis, est  d’élargir les indications de  cette technique PCR à l’identification et la quantification des indicateurs d’hygiène traditionnels (Flore totale, E.coli, coliformes, Pseudomonas spp, Listeria spp) , et/ou  les pathogènes (Salmonelles, Listeria monocytogenes, Cronobacter sakazakii, les STEC comme E.coli O157H7, virus, parasites..)   Cet objectif est aujourd’hui atteint grâce à une nouvelle méthode « de rupture » à prix équivalents aux prix des méthodes culturales

Cette méthode permet, notamment pour les analyses d’autocontrôles soit de les faire en temps réel sur les lignes de production, soit de les faire sur une plateforme d’analyses spéciale robotisée également développée par ADNucleis.

Grâce à son entourage d’industriels partenaires,  ADNucleis  poursuit  sa dynamique de faire de la PCR temps réel un standard industriel notamment par la simplification et la robotisation de l’ensemble du procédé analytique

Kit de diagnostic qPCR Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii)

Kit de diagnostic qPCR Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii) certifié AFNOR disponible chez ADNucleis.

La société lyonnaise se positionne en hygiène alimentaire pour le contrôle rapide des poudres de lait infantile avec son produit phare le kit PCR Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii).

On connait le rôle néfaste de cette bactérie sur les personnes fragiles comme en témoignent les nombreux cas de toxi-infection alimentaire à la fin des années 90 et au début des années 2000 en France avec une mortalité infantile grave de l’ordre de 40 à 80% des enfants atteints.

ADNucleis est certifiée AFNOR pour son produit de diagnostic Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii) NF VALIDATION 16140

Comme tous les kits PCR, l’analyse est rapide (moins de 24h, pré-enrichissement compris)  et le coût particulièrement compétitif puisque ADNucleis a su ramener ses prix au niveau des méthodes culturales à savoir 2 € le kit d’amplification (toutes les plateformes de PCR temps réel sont acceptées pour cette analyse)

Le temps opérateur est très court ce qui donne à la PCR un avantage compétitif indéniable ; il est estimé à moins de 2 mn par échantillon ; le reste du temps est le temps machine.

Contact communication :

Virginie Morel

Veille et communication R&D

v.morel@adnucleis.com