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La qPCR pour lutter contre les risques pathologiques de nos abeilles

La qPCR pour lutter contre les risques pathologiques de nos abeilles

Jusqu’à la fin des années cinquante l’apiculture était essentiellement une apiculture familiale organisée en petits ruchers non transhumants. L’observation “Au trou de vol” était la référence absolue pour évaluer la santé d’une colonie.   Les abeilles de races autochtones en équilibre avec leur milieu alors riche en biodiversité n’étaient porteuses que d’un nombre limité de virus (1 à 2), les principaux agents pathogènes étant plutôt bactériens (loques) et fongiques (nosémoses). Depuis les années cinquante, les pratiques apicoles ont beaucoup évolué et la mobilité des cheptels est devenue la règle tant dans les transhumances pour assurer la récolte du miel que dans les échanges mondiaux de génétique.

Le portage viral s’est amplifié avec pas moins de trente deux virus identifiés à ce jour, une même abeille pouvant abriter 7 à 8 virus différents. La présence dominante de Nosema apis, peu pathogène, au profit de Nosema ceranae beaucoup plus délétère constitue une nouvelle menace sérieuse pour la santé des colonies.

Ce que la recherche a déjà démontré:

La littérature scientifique sur les rôles multiples des pathogènes est particulièrement abondante et nous nous limiterons à quelques-uns parmi les plus déterminants pour les pratiques apicoles.

 Nosema ceranae

Sa présence au niveau de l’intestin peut à tout moment provoquer l’effondrement de la colonie :

– soit par le développement du champignon pathogène en cas de disette, surtout de disette protéique ou en cas d’indigestibilité des sucres proposés aux abeilles

– soit par effondrement du système immunitaire en synergie avec les pesticides

– soit par stimulation des populations virales.

 A propos des virus

Beaucoup de faits doivent retenir notre attention : la transmission des virus peut être verticale :

-toutes les reines sont porteuses de un ou plusieurs virus qu’elles transmettent à leur descendance, on relève la même observation sur les spermatozoïdes,

-les abeilles nourricières excrètent beaucoup de virus par leurs glandes hypopharyngiennes et de fait contaminent les larves,

– Varroa destructor dissémine très largement, soit par portage passif, soit comme hôte de multiplication, un nombre important de virus,

– nombre de virus ne s’expriment pas directement mais induisent le développement d’autres virus présents. Ainsi le virus des ailes déformées peut ne pas produire d’altérations sur les abeilles mais faire apparaître des symptômes de couvain sacciforme car il a stimulé la multiplication des virus S.B.V.

– des symptômes graves de contamination apparaissent avec mille fois moins de particules virales si la pénétration s’effectue par la voie de l’hémolymphe plutôt que par la voie buccale.

Efficacité des moyens analytiques

La grande révolution de ces dernières années a été la mise au point d’une nouvelle méthode analytique , la qPCR (Polymerase Chain Reaction), qui permet d’identifier un pathogène par son ADN ou son ARN (RT-PCR).

L’amélioration des différentes étapes de l’analyse et la multiplication des amorces permettent d’identifier n’importe quel être vivant en quelques heures seulement.

Solu’Nature a conclu un partenariat avec le Laboratoire ADNucleis pour proposer en routine un pack analytique PathoBEE 1 qui permet d’identifier la présence de 10 agents pathogènes.

 

 

Champignons Nosémoses Nosema apis et Nosema ceranae
Bactéries Loque américain Paenibacillus larvae
Virus APV (=ABPV) Virus de la paralysie aiguë
SBV Virus du couvain sacciforme
CBPV Virus de la paralysie chronique = maladie noire
DWV Virus des ailes déformées phénotype A
VDV Virus varroa = phénotype B de DWV
KBV Virus kashmir
SBPV Virus de la paralysie lente
BQCV Virus de la cellule royale noire

L’analyse est réalisée sur 30 à 50 abeilles en mélange car les analyses individuelles ne mettent pas toujours en évidence le portage systématique d’agents pathogènes par abeille et le résultat n’est pas représentatif dans ce cas de l’état d’infection de leur colonie.

Ainsi peut-on mieux comprendre l’effondrement des colonies les plus denses, celles pour lesquelles l’observation “au trou de vol” se révèle la plus rassurante. En effet en cas de surpopulation, le frottement des abeilles entre elles provoquent des micro lésions de la cuticule (au même titre que les acides organiques) qui s’avèrent la porte d’entrée la plus efficace qui soit pour la dissémination des virus.

Attention le risque d’effondrement est important en passant d’une population a effectif normal à une colonie à effectif important. Ainsi le retrait des hausses peut provoquer une brutale augmentation de la densité de la population et amorcer le développement de divers pathogènes.

Dr Gilles Grosmond, vétérinaire expert, solu’nature

 

 

 

 

 

Evaluation des contaminations par levures et moisissures des pâtisseries industrielles par qPCR

Evaluation des contaminations par levures et moisissures des pâtisseries industrielles par qPCR

Evaluation des contaminations fungiques des pâtisseries industrielles par qPCR 

L’étude menée par ADNucleis à la demande de groupe O* a pour objectif d’évaluer une méthode de détection automatisée (incluant l’extraction-quantification des ADN et la PCR quantitative) des microorganismes (levures moisissures) pouvant contaminer les pâtisseries industrielles ou en altérer les qualités organoleptiques.

A ce jour, la méthode industrielle de référence utilisée pour la mise en évidence d’une contamination fungique repose sur la culture sur boite de Pétri contenant une gélose Sabouraud additionnée de chloramphenicol. Elle nécessite une incubation de 3 à 7 jours à 28°C pour pouvoir identifier la présence ou l’absence de colonies.

La méthode automatisée du robot Séquence PRO permet de détecter ces contaminants même en très faible quantité (moins de 10 copies) par détection de leurs ADN à l’aide de la PCR quantitative ou qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction).

L’utilisation de cet automate en industrie agroalimentaire pour l’identification de microorganismes contaminants est en plein développement grâce à son avantage majeur : sa rapidité et sa simplicité. En effet, les résultats de l’amplification de l’ADN cible recherché sont obtenus en moins de quatre heures et permettent un gain important de temps pour une libération des produits finis ; éventuellement en cas de non-conformité, elle autorise une rapide mise en place de mesures correctives nécessaires.

Pour répondre à l’étude demandée par le Groupe O., plusieurs kits d’extraction et d’amplification ont été testés et développés.

De plus, une étude de corrélation entre les valeurs de « Ct » (cycle thermique) obtenus en qPCR et le nombre d’UFC (Unité Formant Colonie) obtenues sur boite de Pétri est effectuée. Cette étude comparative permet de déterminer avec précision, à partir de quel « Ct » les produits finis peuvent faire l’objet d’une libération ou d’un retour, et ceci dans un délai court de quelques heures.

Plusieurs types de kits ont été sélectionnés et développés pour cette étude : 2 kits à spectre large et 2 kits spécifiques.

La première étape de cette étude a été d’identifier spécifiquement les microorganismes qui ont pu être isolés sur les chaines de production. Cette étape a permis de développer un modèle d’étude pertinent en lien avec les problématiques réellement rencontrées en milieu industriel et de sélectionner le kit de détection le plus efficace.

Ces résultats ont montré l’importance d’utiliser des kits à spectre large compte tenu de la variabilité des contaminants.

Adnucleis a mis au point, pour cette étude, différents protocoles de prélèvements et pré-traitements des échantillons afin de réaliser une extraction homogène des acides nucléiques. Nos résultats montrent que la qPCR est capable de détecter des cellules viables contaminantes que les méthodes traditionnelles par Pétri ne détectent pas.

La 2ème partie de notre travail consistait à établir une corrélation entre les résultats obtenus via la méthode traditionnelle en boîte de Pétri et les résultats fournis par le SEQUENCE PRO en qPCR.

Les résultats de l’étude montrent que la qPCR est plus sensible que les méthodes traditionnelles sur boite de Pétri, probablement due à son spectre plus large de détection des cibles recherchées.

La recherche d’une très faible contamination, 1 à 2 colonies par g de prélèvement, peut conduire à utiliser une étape d’enrichissement.de quelques heures : cette méthode permet d’obtenir des résultats plus discriminants pour la détection des contaminants fungiques.

En conclusion, l’utilisation de la méthode qPCR couplée éventuellement à l’enrichissement permet d’obtenir une grande sensibilité pour garantir la qualité de la pâtisserie tout en améliorant sa durée de vie. La sensibilité de la méthode permet de mieux définir voire augmenter la DLC tout en guidant les industriels vers de meilleures pratiques de production.

Yannick Lequette, expert biologie moléculaire chez Adnucleis

* Pour des raisons de confidentialité nous tairons le nom du groupe O.

Votre entreprise souhaite réaliser une étude ? Vous souhaitez mettre en place un nouveau protocole de contrôles sanitaires ? Merci de remplir le formulaire suivant ou contacter directement notre laboratoire au +33(0)4 78 56 79 36

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Robot qPCR SEQUENCE PRO: l’analyse qPCR directement dans votre clinique

Robot qPCR SEQUENCE PRO: l’analyse qPCR directement dans votre clinique

La qPCR dans vos cliniques vétérinaires

Non-opérateur dépendant, le robot SEQUENCE PRO effectue les analyses PCR, incluant extraction, purification et amplification en un seul et unique appareil.

 

  • Résultat quantitatif en 2h30 minimum
  • Distinction infections aigues des maladies chroniques
  • Sur des échantillons non dégradés par le transport
  • Permet un traitement ciblé et rapide
  • Conçu pour être utilisé dans votre propre clinique

La qPCR…accessible

La ligne conductrice de AD Nucléis depuis 15 ans est de démocratiser l’analyse PCR, analyse qui a toujours été proposée en dernier recours par les vétérinaires car trop onéreuse.

L’internalisation de la qPCR permet, en plus de réduire les coûts pour les propriétaires d’animaux, d’obtenir un résultat bien plus rapide, sur des échantillons non dégradés.

Avec un leasing de l’instrument démarrant à 280€/mois et le kit PCR d’analyse compatible Sequence PRO à 8.66 € HT/pathogène, soit 26€ HT pour la recherche de 3 pathogènes (1 Extraction à 5€ HT, 3 amplifications à 7€ HT l’unité)

 …de quoi accélérer l’utilisation de la technique qPCR devenue accessible tout en augmentant la rentabilité du praticien vétérinaire.

Fonctionnalités du Sequence PRO:

Extracteur d’ADN/ARN et amplification PCR en temps réel sur une seule machine

  • Outil de paillasse compact (65cmx65cm)
  • De 4 à 8 échantillons traités par run et jusqu’à 4 cibles par échantillons.
  • Run de 3h et résultats lisibles à distance.
  • 72 kits santé animale (toutes espèces confondues).
  • Prise en main rapide ne nécessitant pas de personnel qualifié en biologie moléculaire.
  • Traçabilité et fiabilité des résultats grâce au lecteur code barre

Kits equins disponibles: Babesia caballi, Theileria equi, Borrelia burgdorferi sl, Leptospira interrogans, Influenza type A, Artérite Virale équine, EHV1, EHV4, Anaplasma phagocytophilum

72 kits toutes espèces disponibles

contact@adnucleis.com ou par téléphone au +33 (0)4 78 56 79 36

 AD Nucléis SAS. Parc Cap Ouest, 24 bis rue du stade, 69290 Grézieu la Varenne, FRANCE

 

L’analyse qPCR simplifiée grâce au SEQUENCE PRO

L’analyse qPCR simplifiée grâce au SEQUENCE PRO

Une explication simplifiée de notre processus de machine automatisée :

Le Séquence Pro

Quel que soit votre niveau d’expérience, nous voulons nous assurer que vous pouvez effectuer un test PCR quantitatif (qPCR) rapidement, efficacement et économiquement.

Introduction à la méthode

Nous vivons à une époque où la génétique nous aide à comprendre de mieux en mieux le monde qui nous entoure, qu’il s’agisse de démêler les histoires évolutives ou de diagnostiquer et de traiter plus précisément les maladies. Mais pour faire tout cela, nous devons être en mesure de trouver et d’examiner des morceaux d’ADN spécifiques. L’un des outils fondamentaux que nous utilisons s’appelle qPCR. Pour pouvoir effectuer une qPCR sur un échantillon, nous devons extraire l’ADN / ARN de l’échantillon, puis l’amplifier pour déterminer quantitativement la présence d’une séquence ou d’un gène cible. Ces différentes étapes prennent beaucoup de temps et une manipulation humaine experte. Nous avons besoin d’une solution simple et rapide.

Nous allons explorer ensemble notre nouvelle machine, le Séquence PRO .

Avantages de la technique qPCR: 3 heures vs 3-7 jours!

Pour détecter une maladie dans le monde vétérinaire, nous utilisons généralement des techniques microbiologiques telles que l’inoculation d’un échantillon sur des plaques de gélose.  Ces méthodes, comme nous le savons déjà, prennent au moins 3 jours pour révéler une contamination.  Les autres techniques utilisées consistent à détecter la contamination à un stade tardif. Cependant, la qPCR prend au plus 3 heures pour  nous  fournir un résultat de contamination précoce ou tardive.  Avec cette technique, vous gagnerez du temps et de la sensibilité.

Une nouvelle machine automatisée, plus rapide et plus facile qu’une technique manuelle de qPCR est nécessaire.

Tout le monde sera en mesure d’effectuer des tests PCR à partir de tous les types d’échantillons et de pouvoir les analyser, d’autant plus que nous devons extraire de l’ADN ou de l’ARN avant de procéder à l’amplification. Notre automate Sequence PRO est un extracteur d’ADN/ARN (de n’importe quel échantillon après un simple prétraitement pour chaque type de prélèvement) et une machine qPCR en même temps. C’est un outil compact qui réduit le temps de diagnostic (jusqu’à 3 heures) et améliore la prise de décision rapide avec traçabilité et fiabilité des résultats. Il consomme 1/30 d’énergie comparé aux autres méthodes de diagnostic, telles que les plaques de gélose. Et le point le plus important est que vous n’avez pas besoin d’être un scientifique pour pouvoir utiliser cette machine et analyser ses résultats.

La solution est fournie avec le Sequence Pro

Sequence Pro différentes parties, contenus et procédures

Entrons dans les détails du Sequence PRO:

Il dispose de 2 ports: Ethernet (pour la maintenance et la mise à jour) et USB (pour connecter le lecteur de codes-barres, le clavier et récupérer les résultats).

À l’intérieur du Sequence PRO, nous avons une petite caméra qui s’assure que les différentes parties de la machine fonctionnent correctement ; nous avons plusieurs bras mobiles : une pipette de 200 μl qui peut fournir un volume mesuré entre 10 μl et jusqu’à 200 μl ainsi qu’une pince robotique pour aider à déplacer les bandes.

Différents modes : mode individuel et mode batch

Une fois que vous aurez choisi votre échantillon, vous aurez 2 options : le mode individuel ou le mode batch ; chaque mode a ses réactifs spécifiques :

Si vous souhaitez utiliser un petit nombre d’échantillons, variant de 1 à 8 échantillons, tout  en étant capable de détecter jusqu’à 4 cibles par échantillon, vous devez choisir le mode individuel. Cependant, si votre objectif principal est de tester 1 cible sur plusieurs échantillons en même temps (14 au maximum) on préfèrera le mode batch. Les prix des deux modes ne sont très proches, mais le mode batch restera plus avantageux que le mode individuel.

Après avoir choisi votre mode, vous disposez de 2 tiroirs : un tiroir pour mettre les réactifs, les échantillons, et une petite poubelle ; et un autre tiroir pour le traitement des échantillons.

Le Sequence PRO, selon le mode sélectionné, sera capable de prendre la barrette d’amplification et la barrette d’extraction, de les stocker à l’intérieur de la machine, puis de prélever un volume de l’échantillon, de le placer dans la plaque deepwell et de commencer la procédure d’extraction basée sur la technique des billes magnétiques. Chaque échantillon nécessite 2 min maximum de manipulation humaine, et le reste du  temps, l’opérateur peut aller se reposer, prendre une pause-café ou continuer d’autres travaux. Après avoir extrait tous les échantillons, l’étape de purification commence et élue votre ADN. Après la purification de l’ADN, les étapes qPCR avec l’amplification commencent jusqu’à ce que nous ayons les résultats finaux.  Ces résultats sont présentés sous forme de valeurs CT, qui correspondent au nombre de cycles de seuil lors duquel le signal commence à devenir plus élevé que le bruit de fond. Plus il y a de matière amplifiée dans l’échantillon, plus le CT est bas et plus le signal est détectable.  Dans les deux modes, vous pourrez visualiser les résultats à l’écran et exporter le pdf détaillé via une clé USB.

Concernant l’installation de la machine, il faut compter 1 journée, y compris les tests qui doivent être effectués pour la validation, l’étalonnage et la formation des opérateurs.

Entretien gratuit la première année, puis un entretien par an.

Pour l’entretien, il est effectué annuellement pour la pipette. L’étalonnage reste robuste si toutes les notes pendant la formation sont respectées.

Différents réactifs et consommables

Nos kits complémentaires au Sequence PRO se composent de packs de 5 barrettes pour l’amplification des cibles et de packs de 10 barrettes pour l’extraction. Toutes les informations détaillées sont publiées sur notre site Web. Si nécessaire, nous pouvons concevoir un kit spécifique en fonction de votre besoin.

Conclusion

En conclusion, notre Sequence Pro propose des tests PCR quantitatifs internes. Il combine l’extraction ADN/ARN  et la PCR en temps réel sur une seule machine. Son utilisation est flexible grâce à sa capacité à gérer presque tous les types de matrices.  Il s’agit d’un outil de paillasse compact (65cm x 65cm) qui réduit le temps de diagnostic et améliore la prise de décision rapide tout en respectant traçabilité et fiabilité des résultats.

Nos équipes de R&D et d’ingénierie sont prêtes à développer tout type de kit avec n’importe quel type de cible et pour tout type de prélèvement (devis étude de cas). Quelque soit votre besoin nous pouvons trouver une solution à vos procédures de diagnostic ou à vos tests dans les domaines de l’auto-contrôle alimentaire, cosmétique, dans la santé humaine et animale…

Nous travaillons ensemble pour être en mesure de répondre à toutes vos questions et tous vos projets.

Dr Racha ZGHEIB

Chef de projet R&D, Adnucleis

 

 

qPCR versus LAMP

qPCR versus LAMP

qPCR versus LAMP

La qPCR (PCR en temps réel) et la LAMP (amplification isotherme médiée par boucle) sont deux méthodes utilisées pour amplifier et détecter des séquences d’ADN spécifiques.

La qPCR est une méthode qui amplifie l’ADN à l’aide de la PCR (amplification en chaîne par polymérase) et mesure simultanément la quantité d’ADN amplifié à l’aide de colorants fluorescents. Le signal fluorescent augmente à mesure que la PCR amplifie l’ADN, et la quantité d’ADN amplifié peut être quantifiée en comparant le signal fluorescent à une courbe standard. La qPCR est très sensible et spécifique et peut être utilisée pour détecter et quantifier de petites quantités d’ADN.

LAMP est une méthode qui amplifie l’ADN à l’aide d’une amplification isotherme (aucun cycle de température n’est requis) et repose sur la liaison spécifique d’amorces à l’ADN cible. La réaction LAMP est suivie par détection visuelle de la turbidité ou de la fluorescence des produits amplifiés. LAMP est également une méthode hautement spécifique et peut être utilisée pour détecter de petites quantités d’ADN, mais elle est moins sensible que la qPCR et peut ne pas être en mesure de détecter des niveaux aussi faibles d’ADN cible.

En bref, la qPCR est une méthode quantitative qui utilise des colorants fluorescents pour détecter et quantifier l’ADN amplifié, tandis que LAMP est une méthode qualitative qui utilise la détection visuelle de l’ADN amplifié. Les deux sont utiles pour détecter et identifier des séquences d’ADN spécifiques.

La qPCR (polymérase en chaîne en temps réel) a plusieurs avantages par rapport à la LAMP (amplification isotherme en boucle):

Sensibilité: La qPCR est généralement plus sensible que la LAMP, ce qui signifie qu’elle peut détecter des niveaux plus faibles d’ADN cible.

Quantification: La qPCR permet de quantifier la quantité d’ADN amplifié grâce à l’utilisation de sondes fluorescentes. La LAMP est généralement utilisée pour la détection qualitative.

Précision: La qPCR est généralement plus précise que la LAMP dans la mesure de la quantité d’ADN cible.

Fiabilité: La qPCR est plus fiable car elle utilise un système de rétroaction en temps réel pour suivre l’amplification de l’ADN cible, ce qui permet d’éviter les faux positifs.

Temps d’analyse: La qPCR est généralement plus rapide que la LAMP, car elle nécessite moins de temps pour amplifier l’ADN cible.

Flexibilité: La qPCR peut être utilisée pour détecter des cibles multiples simultanément, tandis que la LAMP est généralement utilisée pour détecter une seule cible à la fois.

Il est important de noter que les avantages et les limites de la qPCR et de la LAMP dépendent des applications spécifiques et des besoins en matière de détection.